小麦抗白粉病基因Pm60
1. Pm60基因的发现和遗传定位
2009年前后，中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室启动了小麦A基因组供体--乌拉尔图小麦(Triticum urartu, AA, 2n=2x=14)的基因组序列草图绘制项目，他们从世界各地的种质库中收集了大量的乌拉尔图小麦品系，选择了其中遗传关系可能与普通小麦A基因组最近的一个采集自土耳其的品系G1812进行了测序(Ling et al., 2013)。利用白粉病菌系E09对其中部分乌拉尔图小麦品系进行接种鉴定，唐定中研究员课题组发现G1812高感白粉病，但来源于黎巴嫩的PI 428309等品系高抗白粉病，PI 428309/G812的F1代高抗白粉病(图1)，F2代和BC1代的抗、感分离比率显示PI 428309中的抗白粉病基因呈显性主效基因遗传(Zou et al., 2018)。
图1 乌拉尔图小麦PI 428309的白粉病抗性(Zou et al., 2018)
为了定位PI 428309中的抗白粉病基因，利用PI 428309/G812的F2代分离群体构建抗、感DNA混合池，筛选了小麦1A-7A染色体上的259对SSR引物，发现位于7AL末端Bin 0.90-1.00的SSR标记Xwmc273.3-7A与抗白粉病基因连锁。随后利用定位于G1812基因组7AL染色体臂Bins 7AL18-0.90-1.00和7AL16-0.86-0.90的Scaffolds序列开发新的SSR和dCAPS标记，找到与抗白粉病基因连锁的scaf32-5.24(scaffold23784)、scaf48-5.24(scaffold556)和scaf7-3.3(scaffold38068)标记。之后又利用短柄草对应的基因组序列与G1812的序列进行比较开发更多的标记，选用7622个F2分离群体中的1882个感病单株进行精细定位，将抗白粉病基因定位于对应G1812基因组356 kb的物理区间，含有2个注释为NBS-LRR类型的候选基因TRIUR3_00771和TRIUR3_00770(图2)，二者相距27.19 kb，在氨基酸序列上具有70%左右的一致性（Zou et al., 2018。
图2 乌拉尔图小麦PI 428309的抗白粉病基因遗传于物理定位(Zou et al., 2018)
2. Pm60基因的克隆与功能验证
为了克隆该抗白粉病基因，利用TRIUR3_00771和TRIUR3_00770设计引物在抗白粉病品系PI 428309中进行扩增，但未成功扩增到对应的序列片段，说明PI 428309与G1812间在该基因组区域存在较大的序列变异。随后对PI 428309进行了RNA-Seq，从组装的序列中找到了两个与TRIUR3_00771和TRIUR3_00770序列相似性较高的Contigs，根据这两个Contigs的序列进行3’和5’ RACE扩增获得了两个候选基因，分别命名为PmR1和Pm60，在3’-UTR区域观察到了选择性剪切，但在编码区未发现选择性剪切。PmR1和Pm60在蛋白质水平上也具有70%左右的一致性，均编码典型的CC-NBS-LRR蛋白(Zou et al., 2018)。根据PmR1和Pm60基因序列设计的标记M-PmR1和M-Pm60在所有感病重组体中均未扩增出目标DNA片段，表明均与PI 428309中的抗白粉病基因共分离。序列比较发现，G1812中的TRIUR3_00771和TRIUR3_00770蛋白之间氨基酸序列的相似性比PI 428309中对应的PmR1和Pm60蛋白的相似性还高(图3)，证实了G1812与PI 428309相应基因组区域的序列存在较大的变异。
图3 抗白粉病蛋白Pm60的进化分析(Zou et al., 2018)
qRT-PCR分析表明PI 428309中的PmR1和Pm60基因都表达，且PmR1基因的表达在白粉病菌E09接种后不同的时间点均显著上调，但Pm60基因的表达未受白粉菌侵染有较大程度的变化(图4)。
图4 PmR1和Pm60基因表达模式(Zou et al., 2018)
为了确定PmR1和Pm60基因那一个是PI 428309中的抗白粉病基因，利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默体系对PmR1和Pm60基因功能进行了验证。结果表明，在PI 428309中沉默Pm60基因导致了抗性下降，而沉默PmR1基因对白粉病抗性的影响不大，说明Pm60基因是PI 428309中的抗白粉病基因(图5)。
图5 PmR1和Pm60基因的BSMV-VIGS功能验证(Zou et al., 2018)
进一步在G1812和高感白粉病小麦品种科农199叶片中进行了单细胞瞬时表达验证PmR1和Pm60基因功能。结果表明，瞬时表达Pm60时，白粉菌吸器指数显著低于瞬时表达PmR1和空载体对照(图6)，说明Pm60在白粉病抗性中发挥重要作用。
图6 PmR1和Pm60的单细胞瞬时表达功能验证(Zou et al., 2018)
最后又分别构建了PmR1和Pm60基因的表达载体遗传转化科农199小麦品种，Pm60转基因的T0代阳性植株表现白粉病高抗，而PmR1的转基因T0代阳性植株表现白粉病高感。同样，Pm60转基因的T1代阳性植株中也表现白粉病高抗(图7A)，而PmR1的转基因T1代阳性植株表现白粉病高感(图7B)。这进一步证实了Pm60的抗白粉病功能。
图7 PmR1和Pm60的转基因功能验证(Zou et al., 2018)
为深入了解Pm60基因编码的NLR蛋白抗病功能，利用本生烟(Nicotiana benthamiana)系统进行了瞬时表达研究。结果发现，在本生烟叶片中表达全长的Pm60可以诱发细胞坏死，但在Pm60蛋白的N端加上GFP或YFP标签时却未观察到细胞坏死，而在Pm60蛋白的C端加上GFP或YFP标签时却导致细胞坏死，表明Pm60蛋白的CC结构域对于超敏反应具有重要的作用，与其它已知的抗病基因如MLA10、RGA4、SR33和RPS4类似。有意思的是，当Pm60蛋白的N端加上HA标签时，依然具有超敏反应；但当将HA标签分别单独加在CC、NB-ARC和LRR结构域的N端时，却不能引起细胞坏死反应(图8)。
图8 Pm60蛋白在本生烟叶片中诱导细胞坏死(Zou et al., 2018)
此外，由于PmR1和Pm60这两个NLR基因相距很近，利用酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LUC)实验探讨了PmR1和Pm60蛋白的互作。结果显示PmR1基因的CC结构域可以与Pm60发生互作，表明PmR1可能与Pm60一起发挥抗病作用(图9)。
图9 PmR1的CC结构域与60蛋白的互作(Zou et al., 2018)
3. Pm60基因在乌拉尔图小麦中的等位变异
对乌拉尔图小麦品系的抗性鉴定发现，PI 428306、PI 538737、 PI 428196、PI 428310、PI 538751、PI 428210和PI 428215具有白粉病抗性。通过扩增这些品系中的Pm60基因序列，发现前5个品系与Pm60具有完全相同的序列，而PI 428210和PI 428215的编码区存在序列变异。在PI 428210中的NLR基因存在一段240 bp的两个LRR基序缺失，将其命名为Pm60a；而PI 428215的NLR编码区存在一段240 bp的两个LRR基序插入，将其命名为Pm60b。BSMV-VIGS实验证实了Pm60b的白粉病抗性功能，当将Pm60a和Pm60b两个等位基因在本生烟中进行瞬时表达时，都能诱导细胞坏死。与Pm60类似，将GFP或YFP标签加在Pm60a和Pm60b两个等位基因的N端时，不能诱导细胞坏死反应，而加在C端时可以诱导细胞坏死反应(图10)。
图10 Pm60的两个等位基因及其功能验证(Zou et al., 2018)
沈阳农业大学邱永春博士在中国农业科学院作物科学研究所贾继增研究员实验室攻读博士学位期间，在乌拉尔图小麦UR206中鉴定到一个抗白粉病基因PmU，利用分子标记将其定位于7AL染色体末端，介于分子标记Xwmc273和Xpsp3003之间6.0 cM的遗传区段(Qiu et al., 2005)。山西农科院小麦所郑军课题组对PmU基因组区间126个NLR基因的表达研究表明，Pm60和30个NLR基因都表达，并证实PmU与Pm60是同一个基因，Pm60基因功能标记M-Pm60可以在普通小麦中遗传背景中追踪Pm60基因(Zhang et al., 2018)。中科院遗传所沈前华研究员课题组对227份乌拉尔图小麦进行了白粉病抗性鉴定和分子标记筛选，发现有93份乌拉尔图小麦抗白粉病，其中67份材料含有Pm60及其等位基因Pm60a和Pm60b。此外，他们还鉴定出了一个Pm60a的新型感病等位基因Pm60a’，与Pm60相比，具有多个SNP和InDel变异(Zhao et al., 2020)。
参考文献
Ling H, Zhao S, Liu D, Wang J, Sun H, Zhang C, Fan H, Li D, Dong L, Tao Y. et al. (2013) Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature 496: 87–90.
Qiu YC, Zhou RH, Kong XY, Zhang SS, Jia JZ. (2005) Microsatellite mapping of a Triticum urartu Tum. derived powdery mildew resistance gene transferred to common wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 111: 1524–1531.
Zhang L, Zheng XW, Qiao LY, Qiao L, Zhao JJ, Wang JM, Zheng J. (2018) Analysis of three types of resistance gene analogs in PmU region from Triticum urartu. J. Integr. Agri. 17: 2601-2611.
Zhao FK, Li YH, Yang BJ, Yuan HB, Jin C, Zhou LX, Pei HC, Zhao LF, Li YW, Zhou YL, Xie JK, Shen QH. (2020) Powdery mildew disease resistance and marker-assisted screening at the Pm60 locus in wild diploid wheat Triticum urartu. Crop J. 8: 252-259
Zou SH, Wang H, Li YW, Kong ZS and Tang DZ. (2018) The NB-LRR gene Pm60 confers powdery mildew resistance in wheat. New Phytol. 218: 298–309.