铁死亡生信6：一种新的预测肝细胞癌患者总生存期的铁死亡相关标志基因
研究背景&介绍
l 肝癌在恶性肿瘤发病率方面排名第六，是全球第四大肿瘤相关死亡原因。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌类型，与几种众所周知的病因有关，包括慢性HBV或丙型肝炎感染、酗酒、非酒精性脂肪肝和暴露于黄曲霉毒素等食物毒素。HCC病是一种高度异质性疾病，已经在患者间、肿瘤间和肿瘤内水平被记录。HCC病患者的总体存活率在世界范围内差异很大，美国的5年存活率仅为18%。复杂的病因因素，以及HCC的高度异质性，使得预后预测具有挑战性。
l 另外，考虑到HCC有限的治疗策略，还需要开发新的预后模型。铁死亡是一种铁依赖形式的调节性细胞死亡(RCD)，由脂质过氧化的致死性积累驱动。近年来，诱导铁死亡已成为引发癌细胞死亡的一种有前途的治疗选择，特别是对传统治疗有耐药性的恶性肿瘤。除了铁死亡诱导剂，许多基因也被鉴定为铁死亡的调节剂或标记。先前的研究报告称，铁死亡在HCC起着至关重要的作用，目前已知一些基因如CISD1 和TP53基因多态性(S47变体)对铁死亡有负调节作用。另一方面，其他铁死亡相关基因，如Rb、NRF2和MT1G，可能保护HCC免受索拉非尼诱导的铁死亡。然而，这些铁死亡相关基因是否与HCC病患者的预后相关仍然是个未知数。
l 在本研究中，我们首先从公共数据库下载了HCC患者的基因表达谱和相应的临床数据。然后，我们在TCGA队列中构建了一个具有铁死亡相关差异表达基因的预后多基因标记，并在ICGC队列中进行了验证。最后，我们进一步进行了功能富集分析，以探索潜在的机制。
研究流程
图1|数据收集和分析流程图、表1|用于本研究的HCC患者的临床特征
作者在文章中提供研究的流程图如图所示。来自TCGA-LIHC队列的365名HCC患者和来自ICGC(LIRI-日本)队列的231名HCC患者最终被纳入研究。表1总结了这些患者的详细临床特征。
结果解读
1. 在TCGA队列中识别与铁死亡预后相关的DEGs
l 为了系大多数铁死亡相关基因(49/60，81.7%)在肿瘤组织和邻近的非肿瘤组织之间差异表达，其中27个在单变量Cox回归分析中与生存相关(图2a)。
l 不合理的是，HMOX1在肿瘤样本中上调，但其表达在单变量Cox分析中预测了良好的预后，因此将其排除在进一步研究之外。
l 总共保留了26个与铁死亡相关的预后性DEG(全部FDR<0.05，图2b-c)。这些基因之间的相互作用网络表明GPX4、G6PD和NQO1是中心基因(图2d)。这些基因之间的相关性如图2e所示。
图2|在TCGA队列中鉴定候选的铁死亡相关基因。
a. 维恩图，以确定肿瘤和邻近正常组织之间与生存相关的差异表达基因。
b. 26个重叠基因在肿瘤组织中均上调。
c. 显示基因表达和生存之间的单变量Cox回归分析结果的森林图。
d. 从STRING数据库下载的PPI网络显示了候选基因之间的相互作用。
e. 候选基因的关联网络。相关系数用不同的颜色表示。
2. TCGA队列预测模型的构建
l 利用上述26个基因的表达谱，应用LASSO Cox回归分析建立预后模型。
l 基于λ的最佳值鉴定了10基因特征(图S1)。
l 根据每个基因的最佳截止表达值进行的存活分析表明，这些基因的高表达均与不良预后相关(均经调整后P<0.05，图S2)。
l 根据中值临界值，将患者分为高风险组(n=182)或低风险组(n=183)(图3a)。在TCGA队列中，发现较高风险组与较高肿瘤分级、较高甲胎蛋白、较高血管侵犯率和晚期TNM分期显著相关(表2)。
l 主成分分析和t-SNE分析表明，不同风险组的患者分布在两个方向(图3b-c)。如图3d所示，高风险患者比低风险患者更早死亡的概率更高。
l KM曲线始终表明，高风险组患者的生存明显比低风险组差(图3e,P<0.001)
图S1|在TCGA队列中构建10基因签名模型。
a. LASSO系数谱表达26个候选基因。
b. 通过10倍交叉验证选择LASSO模型中的penalty参数(λ）。虚线垂直线按最小准则（左)和“一个标准误差”准则(右)的最优值绘制）。
图S2|根据TCGA队列中每个基因的最佳截止表达值进行生存分析。均调整P<0.05。
图3|TCGA队列中10基因特征模型的预后分析。
a. TCGA队列中风险得分的分布和中值。
b. TCGA群体的主成分分析图。
c. TCGA队列的SNE分析。
d. TCGA队列生存状态、生存和风险评分的分布。
e. TCGA队列中高危组和低危组患者OS的KM曲线。
f. 时间相关的ROC曲线的AUC验证了TCGA队列中风险评分的预后表现。
表2|不同风险组患者的基线特征。
3. ICGC队列中10基因签名的验证
l 对签名中10个基因的存活分析证实，除了CARS外，这些基因与ICGC队列中的不良预后相关(所有调整后的P< 0.05，图S3)。
l 为了测试从TCGA队列中构建的模型的稳健性，来自ICGC队列的患者也通过使用与来自TCGA队列相同的公式计算的中值被分为高风险组或低风险组。在ICGC队列中，高风险组也与晚期TNM分期相关(表2)。
l 与从TCGA队列中获得的结果类似，主成分分析和t-SNE分析证实，两个亚组中的患者分布在离散的方向上(图4b-c)。同样，高风险组的患者更有可能更早死亡(图4d)，并且与低风险组的患者相比存活时间缩短(图4e，P= 0.001)。
l 此外，10基因标记的AUC 1年为0.680，2年为0.690，3年为0.718(图4f)。
图S3|通过WHO2016的综合分析，对分层患者的簇的预后价值进行了分析。
（A）IDH突变型少突胶质细胞瘤和1p/19q共缺失患者的KM总体生存曲线。
（B）IDH突变型星形细胞患者的KM总体生存曲线。
（C）IDH野生型星形细胞瘤患者的KM总体生存曲线。
（D）IDH突变型GBM患者的KM总体生存曲线。
（E）IDH野生型GBM患者的KM总体生存曲线。
图4|ICGC队列中10基因签名的验证。
a. ICGC队列中风险得分的分布和中值。
b. ICGC群体的主成分分析图。
c. ICGC队列的SNE分析。
d. 生存状态、生存和风险评分的分布。
e. 高危组和低危组患者OS的Kaplan-Meier曲线。
f. ICGC队列中时间相关的ROC曲线的AUC。
4. 10基因特征的独立预后价值
l 在可用变量中进行单变量和多变量Cox回归分析，以确定风险评分是否是OS的独立预后预测因子。
l 在单变量Cox回归分析中，风险评分与TCGA和ICGC队列中的OS显著相关(HR= 2.018，95%可信区间= 1.409-2.891，P < 0.001HR= 2.913，95% CI = 1.489-5.699，P= 0.006(图5a，b)。
l 校正其他混杂因素后，在多变量Cox回归分析中，风险评分仍被证明是OS的独立预测因子(TCGA队列:HR =1.953，95%置信区间= 1.356-2.812，P < 0.001；ICGC队列:HR=2.695，95%可信区间= 1.357-5.351，P = 0.005图5a，b)。
图5|TCGA衍生队列(a)和ICGC验证队列(b)中关于OS的单变量和多变量Cox回归分析的结果。
5. TCGA和ICGC队列的功能分析
l 为了阐明与风险评分相关的生物学功能和途径，高风险组和低风险组之间的DEGs被用于进行GO富集和KEGG途径分析。
l 正如预期的那样，在TCGA和ICGC队列中，DEGs富含几种与铁相关的分子功能，如离子通道活性和离子门控通道活性(0.05，图6a，c)。
l 有趣的是，来自TCGA队列的deg在许多免疫相关的生物过程中也明显富集(P. adjust < 0.05，图6a)。ICGC队列验证了六种免疫相关的生物学过程或分子功能，包括趋化因子介导的信号通路、细胞因子分泌的积极调节、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产生的调节、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产生、细胞因子活性和细胞因子受体结合(P. adjust < 0.05，图6c)。KEGG途径分析还表明，细胞因子-细胞因子受体相互作用途径在两组中都得到了丰富(P. adjust < 0.05，图6b，d)。
图6|GO (a，c)和KEGG(c，d)分析的代表性结果。显示了TCGA队列(a，b)和ICGC队列(c，d)中最重要或共享的去氧富集和KEGG途径。粉红色的矩形表示两组之间重叠的免疫相关途径。
图7|TCGA队列(a，b)和ICGC队列(c，d)中不同风险组间的ssGSEA评分比较。
16个免疫细胞(a，c)和13个免疫相关功能(b，d)的分数显示在方框图中。
CCR，细胞因子-细胞因子受体。调整后的P值显示为:ns，不显著；*，P < 0.05**，P < 0.01***，P< 0.001。
研究讨论与总结
l 在目前的研究中，我们系统地研究了60个与铁死亡相关的基因在HCC肿瘤组织中的表达及其与OS的关系。首次构建了整合10个铁死亡相关基因的新预后模型，并在外部队列中进行了验证。功能分析显示免疫相关途径丰富。
l 虽然先前的一些研究表明在HCC中有几个基因可能调节药物诱导的铁死亡，但它们与HCC患者的生存之间的相关性在很大程度上仍然未知。
l 令我们惊讶的是，在单变量Cox回归分析中，大多数铁死亡相关基因(81.7%)在肿瘤和邻近非肿瘤组织中有差异表达，其中一半以上与OS相关。这些结果显著表明了HCC铁缺乏症的潜在作用和用这些铁缺乏症相关基因建立预后模型的可能性。
l 本研究提出的预后模型由10个铁死亡相关基因(ACACA、ACSL3、CISD1、CARS、G6PD、GPX4、NQO1、NFS1、SLC7A11、SLC1A5)组成。
l 然而，在目前的研究中，这些基因在HCC肿瘤组织中都是上调的，并且与不良预后相关。这些基因是否通过影响铁死亡的过程在HCC患者的预后中起作用仍有待阐明，因为除了CISD1和NQO1之外，很少有关于这些基因的相关研究报道。
l 尽管在过去的几年中，肿瘤易感性的潜在机制一直是研究的热点，但是肿瘤免疫和铁死亡之间的潜在调节仍然是难以捉摸的。基于不同风险组之间的差异，我们进行了GO分析，意外地发现许多免疫相关的生物过程和途径得到了丰富。推测铁死亡可能与肿瘤免疫有密切联系是合理的。
l 此外，在TCGA和ICGC队列中的高危人群中，巨噬细胞和Treg细胞的比例较高。先前的研究表明，肿瘤相关巨噬细胞[30，31]或Treg细胞的增加与HCC患者的不良预后有关，因为它们在免疫侵袭中起作用。
l 这项研究有几个局限性。首先，我们的预测模型是用来自公共数据库的回顾性数据构建和验证的，为了验证其临床实用性，需要更多的前瞻性真实数据。其次，仅仅考虑单一标志来建立预后模型的内在弱点是不可避免的，因为HCC的许多重要预后基因可能被排除在外。此外，应该强调的是，风险评分和免疫活性之间的联系尚未通过实验解决。
l 总之，我们的研究定义了一个新的10个铁死亡相关基因的预后模型。在推导和验证队列中，该模型被证明与OS独立相关，为预测HCC预后提供了见解。在HCC，铁死亡相关基因和肿瘤免疫之间的潜在机制仍知之甚少，需要进一步研究。
Thank you！