BCL-2 WB的实验，这三点特别重要
“听过很多道理，依然过不好这一生”，韩寒的电影《后会无期》这句台词深深的直入观众心底，引起了我们的共鸣。相信很多科研汪们也有类似的感慨：
做过很多种实验，依然得不到阳性结果；
投过很多遍文章，依然不能顺利发表；
做过很多次WB(Western Blot)，依然做不出BCL-2……
最近，很多同学在做BCL-2的WB 实验时，总是检测不到条带，问我是什么原因。一开始听到这个问题，我还真不知如何回答，因为原因太多了， 比如：是不是样本中该蛋白的表达不够，是不是WB 实验时转膜方法不合适，是不是抗体选择不对等等都有可能。还一些同学会问，为什么检测到的条带位置与说明书上的不一致？可能的原因也很多：蛋白有没有彻底裂解，抗原表位有没有被遮蔽，封闭液和抗体稀释液是不是最佳的，抗体的特异性如何等。我们再一起来梳理一下如何优雅快速的用WB 检测出BCL-2蛋白。
遇到状况时，具体问题具体分析，仔细排查原因（妈呀，又白板！ ——有问题，别喊妈，先自查）非常重要。可是，那么多次失败的实验真的让我们彻底领悟快速成长了吗？抑或这些经验是否渗入到我们的基因（DNA） 中并指导我们的实践了么？如果我们能领会很多道理的精髓，并付出不折不扣的行动，相信我们的这一生也不会太差，甚至会很美好。同样，我们做WB, 也需要掌握其关键点，才能获得一张赏心悦目的结果图。那WB 成败的关键点有哪些呢？我们认为大致有以下三点：
1 蛋白样本的制备；
2 WB 实验步骤的优化；
3 抗体的选择。
老生虽常谈，但越谈越有味。
1.蛋白样本的制备
蛋白样本成功的制备是WB 实验非常关键的一步。只有高质量高丰度的目的蛋白配上合适的抗体再加上最优的WB 步骤，实验的阳性结果才是妥妥的。因此，获得完整彻底暴露抗原表位的目的蛋白很重要。而在裂解蛋白之前，我们还需要对要研究蛋白的前世今生有个深入的了解，很重要！很重要！很重要！
如果研究的目的蛋白在样本中表达很弱或者根本不表达，我们是很难检测到条带的，或者根本就检测不到。我们可以通过专业的数据库和之前发表的文章来确定目标蛋白的表达情况。多数情况下，我们可从http://www.biogps.org 或者从https://www.proteinatlas.org来看蛋白的表达情况。以BCL-2 蛋白的表达为例（图1，来自于www.biogps.org）, 我们可以看到BCL-2 只在少数细胞系中有中等或偏高的表达，如RPMI 8826，HL-60；这些细胞系的来源一般是骨髓或者淋巴。而SH-SY5Y细胞系中的BCL-2高表达也是因为RA(维甲酸)的诱导才产生。绝大多数细胞系如Hela，HEK-293，HepG2，PC-3及MCF7 等BCL-2 的表达是极其微弱的。对于表达很弱或者不表达的研究样本，我们可以通过过表达或者体外进行诱导先让BCL-2表达，再通过WB 或其他方法来做检测。
图1. BCL-2 各细胞系表达情况
了解了蛋白的表达情况之后，我们可以再通过阅读一些影响因子较高的文献（包括Article 和Review ）进一步了解该蛋白的一些背景知识，如蛋白的亚细胞定位和研究方法等，因为蛋白的定位决定了提取蛋白的方法。通过文献总结，我们得知Bcl-2是一个与细胞生存有关蛋白，它通过抑制线粒体细胞色素c的释放来抑制细胞凋亡的发生(1)。Bcl -2涉及线粒体钙稳态和离子通道调控(2)。Bcl-2常常在Thr56 Ser70，Thr74，Ser87位置发生磷酸化(3)。并且，Bcl-2磷酸化靶向ASK1 / MKK7 / JNK1通路且是有丝分裂标志事件(4、5)。Bcl-2在Thr56或Ser87的突变抑制了糖皮质激素诱导的T淋巴细胞凋亡 (6)。 白细胞介素3和JNK诱导的Bcl-2 Ser70磷酸化可以增强其抗凋亡功能(7)。研究显示，BCL-2 是定位在胞质的核膜（图2A）、线粒体膜（图2B）和内质网膜上的（图2C）。一些非特异性的条带也可以通过超声处理来避免。
图2. BCL-2 亚细胞定位（来自参考文献8）
因此在进行蛋白制备时，在冰上加入裂解液裂解后最好加上超声处理这一步。超声处理一方面通过机械力不断剪切DNA，让蛋白裂解液免受粘稠gDNA干扰；另一方面可以帮助蛋白从膜结构中充分释放出来。
说了这么多，蛋白制备环节的关键在于两点：1）充分了解要研究的目的蛋白及在研究样本中的表达量；2）样本制备的优化条件是：加入适量Cell Lysis Buffer(#9803) 或者RIPA buffer(#9806) 于样本中，冰上裂解15min，随后进行超声处理，以VirTis 探头超声仪为例，超声条件是：输出电功率是30%－40%，10-15s，3次(期间每次间隔15s)，大约电流30A；如果没有超声仪，请用带注射器的针头(20G-18G-16G)冰上反复抽吸，直到裂解液澄清；然后进行离心，取上清蛋白（适合绝大多数样本的制备）。
2.WB 实验步骤的优化
WB 是非常基础的实验，很多同学都掌握得很好，具体原理和步骤就不再一一赘述了，我们把CST 科学家优化的步骤分享给大家，大家在使用CST 抗体做实验时若遇到问题，可以按以下步骤一一去调整：
1）转膜条件：4度，湿转，恒压70v，30min-3h；对于小分子，转膜时间适当减少，并用0.22um膜；对于大分子，转膜时间延长至3h，转膜液中可以加入0.1%SDS且甲醇的浓度减少到5%－10%；
2）封闭：5% 脱脂奶粉／TBST，室温，1h，脱脂牛奶相比BSA具有更好的封闭效果；
3) 洗膜：1xTBST，5min，3次；
4）一抗稀释液和稀释比例参考说明书，二抗稀释液是5% 脱脂奶粉/TBST。
图3 BCL-2 在Jurkat 细胞中的表达（感谢湖南师范大学邱同学友情提供）
图3是邱同学使用CST BCL-2 抗体的结果图，一开始，该同学用 #3498 Bcl-2 (D17C4) Rabbit mAb (Mouse Preferred) 做实验没有条带，经过超声处理和以上方法的优化后，做出实验结果。当实验检测不到条带的时候，我们可以用Jurkat 细胞裂解液作为BCL-2的阳性对照或者通过CST 申请相应的阳性对照。
3.抗体的选择
关于抗体的选择，我们之前写过相关的文章，大家可以参考（原文报道：针对同一靶点的CST抗体那么多，怎么选择？）。通过对全球科研工作者的调查，CST 抗体是研究者们的首选（原文报道：抗体使用者的选择，坚定的信任！）。不知怎么选时，选C（CST） 就对了
。
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结语
天底下有太多的道理，每个人对道理的理解和领悟不一样而导致实践千差万别，因此人生结局各有不同；而我们做WB，不同的蛋白表达丰度和抗体识别的抗原表位不同，因此蛋白制备的方法和WB 的步骤决定了实验的成败。
人生和科研的精彩在于未知性，所以我们才乐此不疲地去设定一个个小目标，然后竭尽全力去实现，至于目标实现与否，只能“谋事在天”了。科研的乐趣在于探索未知，当我们在实验的过程中发现一个很有意思的现象，于是用各种实验去验证自己的假设，最终是“假象”还是“重大发现”，只能同样“谋事在天”了。我想，享受科研与人生的过程，提升自己生命的内涵，掌握科学和实验的key point，才能让自己和世界更美好！
参考文献：
(1) Murphy, K.M. et al. (2000) Cell Death Differ 7, 102-11.
(2) Zhu, L. et al. (1999) J Biol Chem 274, 33267-73.
(3) Maundrell, K. et al. (1997) J Biol Chem 272, 25238-42.
(4) Yamamoto, K. et al. (1999) Mol Cell Biol 19, 8469-78.
(5) Ling, Y.H. et al. (1998) J Biol Chem 273, 18984-91.
(6) Huang, S.T. and Cidlowski, J.A. (2002) FASEB J 16, 825-32.
(7) Deng, X. et al. (2001) J Biol Chem 276, 23681-8.
(8) Yuhihiro, Akao. Et al.(1994) Cancer Research 54,2468-2471.