食品微生物学检验二级和三级采样方案释析的17问与17答
食品微生物检测
答：首先，“致病菌”这个概念的内涵，是可以有区别的。我们说食源性致病菌，有严格意义上的，比如说沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌；也有达到一定含量，或者只对特定人群才有危害的条件致病菌，比如说金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌等。
其次，某个目标待检致病菌，其限量要求是采用二级采访方案，还是三级采样方案，是基于风险分析的基础上而确定下来的。这里的风险，包括了食品样品本身的特性、消费者的饮食习惯、烹饪习惯、食用人群的耐受性等等。
再次，如果某个致病菌限量要求中没有M值的规定，从形式上来看，是二级采样方案。
最后，不论是二级采样方案，还是三级采样方案，其具体的采样过程没有本质差异，有差异的是采样检验后的结果符合性判定。
答：首先，对于有独立包装的样品来说，执行二级和三级采样方案，在一个包装中取五份，是不对的。
其次，n=5是否就一定是5个单独包装，也需要分别对待。如果小包装的一个独立包装量不够单次检验用量的话，那么很明显，这时的n=5，必须要取得独立包装数量肯定是大于5的。
答：首先，对于带壳坚果类样品的微生物检验来说，需要区别对待：像瓜子之类的小颗粒样品，不论消费者的食用习惯是拿手剥开，还是拿嘴嗑开。瓜子壳的微生物状况和水平，都是由食品安全风险方面的实际意义的。检验时建议带壳检验。像核桃这样的较大块头的样品，虽然基本上都是去壳后才会入嘴的，但是外壳较瓜子来说，其对样品整体微生物的水平值贡献很大，因为，这类样品一般不容易破损，内仁基本上不会有菌。如果去壳后检验，将是很低的结果，不能反映出产品在生产过程中的卫生控制是否到位。所以，也不建议去壳检验。
其次，如果采用去壳检验的方式，需要高超的无菌操作技能，否则很容易污染。比如说去壳工具的灭菌是否彻底，或是检验人员的面临的实际操作难题，比如说瓜子这么小的样品怎么样无菌去壳，再比如说检样大肠菌群要求一份样品在15分钟之内完成，去壳的话，时间上够吗？！
那一个大包装里面有几十个小包装，可不可以算作5个包装呢？
答：只要这些小包装是符合独立包装的样式，且单个小包装的量够单次检验用量，就可以算做是n的一份。
不过，话说回来，除非是大包装（单个超过1000g或者1000ml），一般建议还是尽量少采用这样的方式，没有必要。一是省不了多少钱（检验成本）；二是实际上的取样样本量是缩小了，有一定的风险。
如果是食品增稠剂采25g稀释液十分浓稠稀释不了，可以增大稀释量吗？
答：对于案例中的这类样品，由于其物理特性的限制，采用正常的25g+225ml的1：10的比例，无法得到流动性较好的稀释液，那么，可以增大稀释比例，但是最终结果的计数或报告计算时，不要弄错。建议实验室有自己的SOP，规定对同一类这样的样品恰当的稀释比例，避免出现实验员操作不一致。
网兜装（没有密封）的没塑料外包装的粽子 能采取二级抽样方案吗？需要无菌采样吗？
答：首先，我在交流中提到了二级和三级采样方案的应用，并没有局限在预包装食品（或者是包装食品），GB4789.1-2016标准中也说明了可以应用于散装食品和现制现售的食品。
其次，不论是不是二级采样方案（或三级采样方案），对于没有包装，或者有包装但是不密封的样品，无菌采样是基本原则。否则，样品本来应该无阳性检出，结果检出了；或者计数结果超标了，怎么能够一定就认定是产品质量问题呢？！难道不是由于非无菌采样引入的污染导致的？！
再次，就这个案例来说，如果这个产品的执行标准中没有限制为预包装范围（或包装范围），而是所有包装样式的样品都设定了二级或三级采样方案的限量要求，那么照着执行，用无菌操作的方式取足满足二级或三级采样方案的样品量，进入实验室检验，是没有问题的。但是，如果这个产品的标准中，其限量要求如果设定的是二级和三级方案，但是有样品包装样式的限定范围，那么就需要注意。再如果该产品标准中，如果其限量要求压根就不是二级和三级方案，那也没法进行二级采样方案检验。
最后，就事论事，网兜，根本就不算是个包装，至多算个容器而已，方便消费者携带而已，其对产品的防护作用，在微生物方面，基本上是不起作用的！
检样可以按比例稀释吗？必须取25g？
答：首先，这个问题的提法在文字表述上是有点问题的，其实正确的提法应该是“检样可以不取规定量，但是稀释过程比例保持不变吗？必须取25g？”
其次，固体样品单次检验取样25g加入到225mL稀释液中进行1：10的比例稀释，混合均匀得到第一稀释度的做法，是目前食品领域各个标准的普遍规定。这是综合考虑了检样样品量、检验成本、检验方法的灵敏度、检出限而得出的。就检验灵敏度而言，25g+225mL与10g+90mL这两种稀释方式，虽然稀释比例是一样的，但是很明显灵敏度是有差异的，尤其是定性检验。
一般而言，没有特殊情况，不取25g这样的做法，是不可取的！除非是样品属于贵重样品，非常值钱，则另当别论！特别是客户委托检验，送样给检验机构，不满足单次25g样品量的情况，尤其是不可取的；不在报告中特别注明，不进行有效的合同评审，那么这份报告，可以上升为作假的性质！
再次，如果是贵重样品，需要减少单次检验用量，请务必保持稀释比例不变；如果检验量和稀释比例都缩小，我个人认为是一种对检验行为没有敬畏之心的“无耻行径”！
n=5,c=0,m=10 中结果为＜10，＜10，＜10，＜10，5 这个结果合格吗？可以出报告吗？
答：n=5,c=0,m=10，其限量要求及结果，需要分别对待。以平板法计数结果为例，该案例具体为n=5,c=0,m=10CFU/g（mL）。对固体检样来说，这里的m=10CFU/g，正好是检出限的数值。问题实际上转化成了＜检出限的定量检验结果如何报告的问题。出现单次结果是“5（CFU/g）”，我能理解，不外乎就是除最低稀释度外的其他稀释度平板都不生长，最低稀释度平板中的一块长了一个菌，另外一块不生长。这个问题其实与二级和三级采样方案，没有必然联系；就算不采用二级和三级采样方案，在实际工作中也会碰到。我个人建议这种情况按照”10CFU/g“的结果报。
下面稍稍阐述一下我的这种观点的理由：
从形式上看，既然两块平板最低稀释度的两块平板都不生长，报了“＜10CFU/g”这样的结果，那么出现“5CFU/g”这样的结果，不是结果报告形式上的双重标准了吗？！
从结果的实际意义来看，两块平板，一块生长，一块不生长。平行比较而言，生长的那块不能说明自己生长的必然性，不生长的那块也不能自证自己不生长的必然性。两块平板的结果都带有很强的偶然性。从与两块平板都不生长的情况比较而言，当然是属于不太好的结果，按照从严要求，当然应该视为与两块平板都各自生长了一个的情况风险相同。所以报“10CFU/g”的结果。
有人要质疑我凭啥从严要求？好，我退一步讲，不从严，咱从宽，那也应该报“＜10CFU/g”这样的结果，哪里轮的上出现“5CFU/g“这样不伦不类的结果呢？！
其次，如果案例是液体样品，那么，我相信是没有问题的了，而且能够印证我前面的观点。如果液体样品出现两块平板，一块不生长，一块长一个。谁也不会报“0.5“的结果吧？！大家都是自动进成”1“的结果。尽然同样是小于检出限，但是有了这么尴尬数值的结果，那么凭什么液体就按照检出限来报告，固体就非要搞个在检出限之数值来报告呢？！
想咨询 关于餐具的采样 污染浓度达到10的2左右的大肠杆菌 采样用VRBA培养？
答：该问题的文字表述不完整，详见下面第13个问题。
答：简而言之——定量检验，其结果是能够得到单位质量或单位体积内微生物的数值水平，及含量（浓度值），我们由定量检验的结果单位可以看出，如CFU/g、CFU/mL、MPN/g、MPN/100g等等。定性检验，其结果是能够得到单位质量或单位体积内微生物阳性结果或阴性结果的结论，比如说“未检出/25g“、”检出/25mL“等等。
定量检验，都有明确的检出限；可以开展实验室内和实验室间的比对，比对或者能力验证的结果，不仅仅有通过与否的定论，更有可以反映自己实验室定量检验准确性、规范性程度的量化指标结果。
定性检验，因为结果是直接定性的，属于“非此即彼“的性质，需要特别注意”假阳性“和”假阴性“的问题。
对于二级采样方案来说，m=0，定量检验，就是限量要求不超或检出限的含义；定性检验，就是不得检出的含义。
定量检验报“＜检出限“的结果，定性检验报”未检出/单位质量（或单位体积）“的结果。
定量结果没有就报0，定性没有就是未检出，是这样吗，没听见
详见上面一个问题。
定量检验报“＜检出限“的结果，定性检验报”未检出/单位质量（或单位体积）“的结果。
答：首先，提问者是什么目的？是想制定企标或者内控标准吗？
其次，肉制品各个类别产品的国家标准对于指示菌指标都有明确规定；GB 29921-2013标准中对于其致病菌指标，也有明确规定。n、c、m和M值都是给出了。
最后，如果是基于第一点的目的或者是想钻研第二点的设定原因，推荐阅读国际食品微生物标准委员会（ICMSF）食品微生物丛书的第八册《食品加工过程的微生物控制 原理与实践》。这本书我在交流中也提到了，该书的中文版，由刘秀梅老师主持翻译，中国轻工业出版社2017年4月第一版。购物网站可以搜到。该书的“第二篇 各类食品的应用原则“，其中的”8 肉制品“、”9 禽肉制品“等章节，会告诉提问者明确的说法的。
餐具的采样 (小铁碗) 如果说大肠杆菌的数量达10的2次方左右 用无菌滤纸采样 用平板计数法 VRBA培养基培养 具体的采样怎么采呀？
答：餐饮具的现场采样，与食品的二级和三级采样方案，没有关系。最起码，目前这方面的国标《GB14934-2016 食品安全国家标准 消毒餐（饮）具》的微生物指标没有采用二级和三级采样方案。
提问者所问的“采样“的内涵实际上与二级和三级采样方案中的”采样“一词的内涵，是两码事！至于餐具的采样，可以参看GB14934-2016标准的附录A。
答：提问者指的是我课件中第三部分“一些误区“的”思维定势之一：二级和三级采样方案与检验方法的关系“中的那个例子吗？
如果是的话，我只能说，提问者的理解有误！
我这个案例的目的是为了证明二级和三级采样方案的具体设定与所对应的检验方法，两者之间是没有必然联系的。这个案例中大肠菌群是采用了常见的三级采样方案，但是其限量要求是按照检验方法为MPN法而得出的。不考虑具体的数值设定是否科学合适，只说这样的设定方式，是完全可以的。MPN法是（半）定量检验的方法，不是定性法。
答：提问者问题的实质，我的理解是MPN法结果与平板法结果，是否可以进行比较？什么样的MPN法的结果，可以与一定数值的平板法结果大致等同？
这个问题，简而言之，想把MPN法检测法转化成平板法，首先需要积累一定的MPN法检测的结果数据，然后分析分析其所对应的置信区间的上下限。有个简单粗暴的说法——同一个样品分别用MPN法和平板法检测，如果平板法的结果，落在了MPN法结果置信区间的上下限之间的话，可以认为这两个结果具有可比较的意义。也即是通常意义上认为的结果大致相当。
关于这个问题和MPN法的一些基本理论与实践困惑，可以在以后专题来讲。
现场制作食品，做致病菌项目也是采5个样做，但是29921只适用于预包装食品，怎么解析？
答：从合规性角度来说，GB29921-2013标准的规定不适用于现制现售食品。
从食品安全风险角度来说，现制现售食品，基本上不会存在很长的保质期，消费者也不会放置很长时间后才食用。只要现场制作的环境、人员、工器具等卫生要求达标的话，是不会存在致病菌风险的。
当然，如果出现食物中毒等食品安全公共卫生事件的话，那么检测致病菌是必要的，但是此时由于检测目的不同于批次合格判定，所以，也不会执行GB29921-2013标准规定来下结论的。