浙江大学：间充质干细胞外泌体掺入3D打印的“生物墨水”中用于软骨缺损再生
浙江大学医学院邵逸夫医院的范顺武教授团队新近在Theranostics发表文章，报道了3D打印的ECM/GelMA/外泌体支架，促进缺损区域中的软骨细胞迁移并可持续释放外泌体，最终促进软骨缺损再生。
骨关节炎（OA）是最普遍的慢性关节疾病。关节软骨损伤被认为是青少年和年轻人早期OA的重要原因。植入支架或软骨修复手术是早期OA患者保守治疗失败后的一个很好的选择。在正常营养条件下，软骨细胞的合成代谢和分解代谢活动存在动态平衡，这主要依赖于糖酵解来满足其基本能量需求。在营养应激期间，软骨细胞表现出灵活的代谢，并且可以通过三羧酸循环增强线粒体呼吸来维持细胞活力和细胞外基质（ECM）合成。在OA中，软骨细胞丧失其代谢灵活性，减少其细胞线粒体生物合成，并增加其线粒体DNA（mtDNA）损伤。OA软骨细胞中的线粒体损伤进一步降低了ATP合成并损害了软骨细胞的合成代谢。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）广泛应用于软骨再生研究。然而，这种类型的疗法具有诸如致瘤性、免疫不相容性和染色体畸变的局限性。因此，重要的是制定可充分利用干细胞特性并避免这些缺点的策略。外泌体（直径30-150 nm）是一类细胞外囊泡，具有与它们来源的细胞类似的功能。研究报道，MSCs具有可能的免疫原性和致瘤性。然而，MSC外泌体不具有这种有害潜力。已经有研究提出MSC可以通过外泌体重复出MSC的治疗效果。最近的研究发现，外泌体可以维持软骨基质蛋白COL2A1在软骨细胞中的表达，并且在人重组白细胞介素-1β（IL-1β）处理下降低软骨基质降解标记物ADAMTS-5的表达。现在的证据表明，外泌体在细胞间线粒体通讯中发挥重要作用。细胞之间的信息传递可以通过线粒体基因组介导，甚至整个线粒体也是可移动的。然而，外泌体调节软骨细胞线粒体的机制仍然未知。因此，该研究试图探索MSC外泌体对线粒体稳态的影响。
最近的研究表明，软骨细胞迁移是软骨缺损愈合过程中的主要因素。因此，必须在用于软骨组织工程的支架中考虑细胞募集能力。以前，该研究团队通过冷冻干燥和热交联制造了具有径向取向通道的胶原支架。结果表明，与随机结构相比，这种支架具有更好的细胞募集能力。然而，支架生产过程基于物理冷冻干燥，并且需要建立优化的制造方案。脱细胞技术可以保留天然组织ECM，同时去除特定的组织或器官细胞，以最大限度地减少体内免疫排斥。脱细胞ECM含有丰富的肽，例如胶原蛋白、纤维蛋白和蛋白多糖，并且由这些肽暴露的matricryptic位点可以促进细胞粘附和迁移。此外，研究表明脱细胞ECM植入体内后3-4天内巨噬细胞数量增加，这种免疫反应可以促进后期组织再生。用天然聚合物如纤维蛋白、明胶或透明质酸模拟传统的光交联技术是困难的，特别是当使用更难制作的3D模型时。该研究应用桌面立体光刻（SLA）技术进行高分辨率和光交联生物材料打印，以实现软骨再生的改善。该“生物墨水”由MSC外泌体、脱细胞软骨ECM和明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝胶组成。
实验方法如下，首先检查了正常和OA人软骨样本中的线粒体相关蛋白，并研究了MSC外泌体是否可以增强体外线粒体生物合成。随后设计了用于MSC外泌体递送的生物支架，并使用台式立体光刻技术制造了具有径向定向通道的3D打印软骨细胞外基质（ECM）/明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）/外泌体支架。最后，使用兔模型评估3D打印支架的软骨缺损修复能力。
用于促进软骨缺损再生的一步操作系统的示意图。（A）基于立体光刻的ECM/GelMA /外泌体生物打印和软骨缺损植入。（B）软骨细胞向缺损区域的迁移。（C）通过3D打印支架控制外泌体的施用。（D）通过支架增强软骨细胞线粒体生物发生。
如方案图所示，通过SLA技术成功地制造了具有径向定向通道的3D打印的ECM/GelMA/外泌体支架。支架可促进缺损区域中的软骨细胞迁移并可持续释放外泌体，并且MSC衍生的外泌体可被软骨细胞内化。通过补充外泌体中的线粒体相关蛋白，支架可以增强线粒体的生成并恢复软骨细胞中功能失调的线粒体。最后，通过这种一步操作系统可有希望实现软骨缺损再生。
参考文献：
Chen P, Zheng L, Wang Y, Tao M, Xie Z, Xia C, Gu C, Chen J, Qiu P, Mei S, Ning L,Shi Y, Fang C, Fan S, Lin X. Desktop-stereolithography 3D printing of aradially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 2019 Apr 13;9(9):2439-2459.doi: 10.7150/thno.31017. eCollection 2019.
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