看见病毒：显微镜的百年历程
突然袭来的新冠肺炎疫情让人类又一次见识了“病毒”的威力。
肉眼看不到的病毒作为一个物种，很可能从地球生命诞生之初就已经存在，而人类从意识到有病毒存在→看到病毒的模样→弄清病毒的内部结构成分却经历了漫长的过程。病毒在19世纪末已被证实肯定存在，但因“阿贝极限”使光学显微镜无法达到更高的分辨率，始终看不到病毒的踪影。
撰文 | 小溪
来源：中科院高能所
20世纪30年代，电子显微镜的发明使神秘的病毒终于现出了真身，只是电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的观察及获取生物活动的动态信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的动态过程。
科学界期待着能有可获取生物过程动态信息的、更高分辨率的光学显微镜。
光学显微镜的“阿贝极限”究竟有没有可能被突破呢？
尽管每项科学技术的发展都会历尽艰辛，只是没想到，真正突破“阿贝极限”竟用了百余年，在此期间数项新技术的发明起到了极为关键的作用！
相 衬
“相衬”是显微技术中的一个重大进步。
光学显微镜观察细胞时一般都需要染色，这是因为细胞结构中大部分组分都是透明的。透明度高的物体也称为位相物体，光波通过位相物体时不改变振幅 (光的强弱) 只改变位相，但人眼只能辨别出振幅的变化，因此在光学显微镜下难以区分不同的细胞组分。
用有机染料对不同的细胞组分进行选择性染色后，可借助不同的颜色反衬来提高细胞不同组分图像的对比度，便于更清楚地进行观察和研究。但染色是一个非常困难和耗时的过程，常常会对观察的生物样本产生伤害，甚至杀死细胞。
波的位相示意图
有没有办法让光学显微镜的生物样本可以不经染色而直接清楚地观察到活细胞的内部结构呢？
20世纪30年代初，荷兰的弗里茨·泽尼克 (Frits Zernike) 在实验中偶然发现：不可见的光相位变化可以转变为可见的振幅变化，他根据位相理论研究出了位相反衬法 (一种光学信息处理方法) ，通过某种空间滤波器将位相变化产生的不可见信息转化为与之等价的可见的振幅信息，改善透明物体成像的反衬度，可大大提高透明物体的可分辨性。
弗里茨·泽尼克(Frits Zernike)
泽尼克利用光的干涉原理，在传统的光学显微镜中加入相位板 (将位相差转换成振幅差) 研制出相衬显微镜 (Phase Contrast Microscope，简称PCM) 的原型机并申请了专利，可惜当时他的发明没有受到重视。
第二次世界大战的爆发影响了泽尼克的研究，但他以百折不挠的精神不断改进技术。1941年，第一台实用的相衬显微镜终于在蔡司公司诞生。当时的显微镜观察细胞时都需要染色(染色会杀死细胞) ，而相衬显微镜则可直接观察到活细胞的内部结构。
目前，大部分高级光学显微镜及电子显微镜中都配置了相衬部件。相衬显微镜在细菌学、病理学等方面应用广泛，生物学研究因此有了极大突破(泽尼克因论证相衬法及发明相衬显微镜的贡献获1953年诺贝尔物理学奖)。
早期的相衬显微镜
下排是透明样品加上相衬技术后的显微图像
荧 光
荧光的发现为后来超分辨率光学显微镜的研制打下了基础。
早在1845年，英国皇家学会的约翰·赫歇尔 (John Herschel) 在一份报告中描述了他观察到的一种现象：加了硫酸奎宁 (一种药物) 的苏打水在太阳光照射下会发出天蓝色的光。以后，虽然也有人发现类似的现象，但一直没人能给出科学的解释。
约翰·赫歇尔(John Herschel)
1852年，英国的乔治·斯托克斯 (George Stokes) 在他的巨著《论光的折射率变化 (On the Change of Refrangibility of Light) 》中指出：用分光计观察太阳光照射奎宁和叶绿素的水溶液时，只有当溶液置于光谱的紫外光区域才会产生所发光的波长比入射光波长要长效果。
斯托克斯判定：这种现象是由于这些物质吸收光能后重新发射出不同波长的光 (属光致发光)，并非因光的漫射作用引起，他把这种光称为荧光 (Fluorescence)。
1864年他在一次演讲中首次提出：荧光可作为一种分析工具，可惜他的建议没能被很快地应用于光学显微成像技术。
乔治·斯托克斯(George Stokes)
过了40多年，德国的奥古斯特·科勒 (August Köhler) 与亨利·西登托普夫 (Henry Siedentopf) 于1911年研制出首个荧光显微镜 (Fluorescence Microscope) 测试装置。
当时的荧光显微镜以紫外光线为光源，用荧光色素对观测目标 (细菌、植物、动物组织等)进行染色处理，紫外光的照射会激发观测目标上的荧光物质发出荧光，研究者根据自发荧光的成像开展研究。
荧光显微镜可用于观察细菌、植物和动物组织中的自发荧光现象。但因植物和动物组织中的自发荧光很弱，加之当时相关的技术还不够成熟，荧光显微镜的应用在20世纪初期发展较慢。
奥古斯特·科勒(August Köhler)、亨利·西登托普夫(Henry Siedentopf)
第一台荧光显微镜测试装置
20世纪30年代后，得益于各相关科学领域技术的进步和创新，荧光显微成像技术迎来了新的发展机遇。
1935年，奥地利的马克斯·海廷格 (Max Haitinger) 等人改进了生物组织标本的染色技术，用荧光色素染色来标记不能自发荧光的特定组织成分、细菌和其它病原体，标本的荧光亮度增强了，在荧光显微镜下可观察到生物组织的续发性荧光。20世纪50年代，随着荧光抗体标记方法及荧光显微镜装置的改进，荧光技术的应用逐渐推广。
日本的下村修 (Osamu Shimomura) 等人1962年从维多利亚水母中发现了一种奇特的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其受激发而发出绿色荧光。1974年，他们得到了这种蛋白的纯化物，称为绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein，简称GFP) 。绿色荧光蛋白的最突出特点是光毒性比传统的荧光分子弱得多，非常适合用于对活细胞进行标记。而基于绿色荧光蛋白的光学成像技术可使观察者直接看到从微观到宏观各个层次的生命现象。
下村修(Osamu Shimomura)
在发现绿色荧光蛋白20多年后，美国的马丁·查尔菲 (Martin Chalfie) 于1993年通过基因重组技术使除水母以外的生物 (大肠杆菌等) 也产生出绿色荧光蛋白。他将绿色荧光蛋白真正应用于生物样品的标记，建立起用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法。由于许多重大疾病都与基因表达异常相关，查尔菲的成果意义重大。
美籍华人钱永健 (Roger Y. Tsien) 大幅度改造优化了绿色荧光蛋白，提升了它的发光效率，还进一步发展出红、蓝、黄色的荧光蛋白，在生物学研究领域得到了广泛应用。这些荧光蛋白成为生物学家们得心应手的工具，实时监测各类病毒“作案”过程的愿望已可以实现了。
下村修、查尔菲与钱永健三位科学家因发现、提取和改进绿色荧光蛋白的杰出贡献获得了2008年诺贝尔化学奖。
马丁·查尔菲(Martin Chalfie)
钱永健(Roger Y. Tsien)
荧光显微镜
荧光标记的重组病毒感染模型系统
激 光
“强光源”也是迫切需要解决的关键技术！
阿尔伯特·爱因斯坦 (Albert Einstein) 1916年提出了“关于辐射的量子理论 (On the Quantum Theory of Radiation) ”，其中包括“受激辐射的光放大 (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation，简称Laser) ”的概念 (中文译为激光)，这是如何得到强光源的一个思路，他的论述为后来激光的实现奠定了理论基础。
但在自然界普通光源中，产生受激辐射的成分很少，当时的人们并没认识到该理论的实际应用价值。
阿尔伯特·爱因斯坦(Albert Einstein)(左)，他1916年发表的论文(右)
基于爱因斯坦的理论，几十年之后的1953年，美国的查尔斯·唐尼斯 (Charles Townes) 研制成功一台受激辐射微波放大装置。后来该项技术由微波扩展到红外及可见光范围。
1958年，唐尼斯与亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理评论(Physical Review)》杂志上发表论文，阐述了研制激光器的可能性以及所需的条件，指出这种激光具有亮度极高、单色性好、方向性好的特点。
就在同一时期，苏联的亚历山大·普罗霍洛夫 (Aleksandr Prokhorov) 及尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov) 也提出了类似的设想。他们的设想非常吸引人，许多国家竟相开始研制激光器，各种实验方案都有，只是都未获得成功。
这几位都是了不起的人物，赫赫有名的科学大伽，爱因斯坦就不用说了。而唐尼斯、普罗霍洛夫及巴索夫三人分享了1964年诺贝尔物理学奖，肖洛则获得了1981年诺贝尔物理学奖。
亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)、查尔斯·唐尼斯(Charles Townes)
亚历山大·普罗霍洛夫(Aleksandr Prokhorov)、尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov)
真正研制出第一台激光器的是美国加利福尼亚州休斯航空公司实验室的西奥多·梅曼(Theodore Maiman)。1960年5月16日，梅曼在自己研制的红宝石激光器上成功获得了波长为694.3纳米的激光。7月7日，休斯公司正式宣布了这个消息。此后，不同工作物质的激光器陆续研制出来，如氦氖气体激光器、二氧化碳激光器等，激光在各领域的应用研究也迅速展开。
激光的亮度可比普通光源高20个量级，而且是在包括红外､可见光､紫外直至X射线波段内的相干辐射光源，意义极为重大，因此被誉为是20世纪继原子能、计算机、半导体之后的又一重大发明。梅曼获得富兰克林学会、美国物理学会、光学学会等多个奖项，曾两度被诺贝尔奖提名，可惜未能获得诺贝尔奖。
西奥多·梅曼(Theodore Maiman)与他研制的红宝石激光器
共聚焦
激光技术的突破使另一关键技术——“共聚焦成像”的构想有了成功的可能。
共聚焦成像 (Confocal Imaging) ”的构想是美国的马文·明斯基 (Marvin Minsky)(被称为“人工智能之父”) 在20世纪50年代提出的。
其原理是利用逐点扫描照明，并用空间针孔滤波手段去除样品焦点平面外散射光进行共聚焦成像。他为此设想申请了专利，也研制出一台共聚焦扫描显微镜的样机。
但当时缺乏适用的超强光源，加之数据处理能力也还达不到所需的标准，这个构想实际上只停留在理论阶段。
马文·明斯基(Marvin Minsky)
明斯基研制的共聚焦扫描显微镜样机
梅曼的激光器研制获得成功之后，美国的保罗·达维多维茨 (Paul Davidovits) 和大卫·埃格尔 (David Egger) 于1969年以氦氖激光器为激发光源，制成了一台激光扫描显微镜原型机。
1978年，德国的托马斯·克里默 (Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟首次提出了共聚焦激光扫描显微镜 (Confocal Laser Scanning Microscope，简称CLSM) 的设计方案：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，用激光聚焦逐点扫描方式结合荧光标记生物样品的三维探测方法，通过计算机处理手段重构生成三维图像(与扫描电子显微镜类似)。
真正商业化的共聚焦激光扫描显微镜于1987年问世。
克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)、托马斯·克里默(Thomas Cremer)
共聚焦激光扫描显微镜
从理论上说，该项技术的光学成像空间分辨能力并未真正突破“阿贝极限”，但其所得的物像分辨率比传统的光学成像提高了30%~40%，大大优化了成像质量。
共聚焦激光扫描显微镜现已成为使用广泛的高分辨率三维光学成像工具，通过移动透镜系统对半透明物体进行三维扫描，在计算机系统的辅助下，对样品从外观到内在、从静态到动态、从形态到功能进行全方位的观察。
真正突破
对“阿贝极限”的真正挑战要从20世纪90年代说起。
1994年，德国的斯蒂芬·黑尔 (Stefan Hell) 提出了受激发射损耗 (STimulated Emission Depletion，简称STED) 技术，用以突破“阿贝极限”实现超高分辨率成像。所谓“阿贝极限”，是光学元件的衍射效应造成的。
光学显微镜的照明光经光学系统聚焦后在样品上形成的光斑实际上是个光的衍射斑，在此斑范围内的样品会发出照明光引发的荧光，使这部分样品的细节信息无法被分辨。要实现超越“阿贝极限”，关键是设法减少单个扫描点处的有效荧光发光面积。
黑尔提出的方法十分巧妙，他设想同时使用两束激光来照射样品，一束为激发光，另外一束为空心形的受激发射损耗光，样品上发生受激发射损耗效应的部分不能发出荧光，仅样品的中心区域可发出辐射荧光，这样就可达到大大降低荧光激发半径的目的。
可以想象，实现这项技术的难度相当大，黑尔于2000年终于用两台钛宝石飞秒脉冲激光器实现了超高分辨率受激发射损耗显微成像。
斯蒂芬·黑尔(Stefan Hell)
除了受激发射损耗显微技术，还有几项重要的技术获得了突破。
美国的埃里克·白兹格 (Eric Betzig) 与威廉·莫尔纳 (William Moerner) 分别独立发现了单分子开关的方法，利用图像多次叠加的技术得到单分子的精确定位，再将这些分子的荧光图像合成，可获得比传统光学显微镜至少高10倍以上的分辨率。
白兹格将该项技术称为光激活定位显微术 (Photo Activated Localization Microscopy，简称PALM)。
埃里克·白兹格(Eric Betzig)
威廉·莫尔纳(William Moerner)
美国哈佛大学的华裔女科学家庄小威 (Xiaowei Zhuang) 等人发明了利用有机染料 (不用荧光蛋白) 对荧光分子的可调控性对单分子进行精确定位，再用图片重组方式获得超高分辨率显微镜图像的技术——随机光学重建显微术 (STochastic Optical Reconstruction Microscopy，简称STORM) 。
庄小威积极推动了这项技术的发展，既实现了三维同时超分辨率显现，又进一步提高了该技术的成像速率 (庄小威的成果与埃里克·白兹格的成果在2006年同时发表，只是庄小威投稿的日期晚了4个月)。
庄小威(Xiaowei Zhuang)
正是由于上述多项技术的创新，光学显微镜最终实现了“阿贝极限”的真正突破 (分辨率达20纳米)，使能进行活体物质观察的光学显微镜又重新焕发出青春，这对多个前沿研究领域产生了重大影响，尤其是为常温下活体生物学研究带来了重大机遇。
生物学家们能够实时观察到生物分子如何在大脑神经细胞之间生成神经突触，看到病毒颗粒侵入细胞的全过程，甚至还可追踪帕金森、阿尔兹海默症、亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积过程 (莫尔纳、黑尔、白兹格三人被授予2014年诺贝尔化学奖(很遗憾庄小威未能获奖))。
突破“阿贝极限”的光学显微镜
受激发射损耗显微镜(STED)(左)与一般光学显微镜图像(右)的对比
共聚焦显微镜(CLSM)(左)与受激发射损耗显微镜(STED)图像(右)的对比
难能可贵的是，黑尔在获诺贝尔奖之后给自己制定了进一步提高分辨率的奋斗目标——被他称为“后诺奖超分辨率”。
2017年初，他的团队在Science发表了题为“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的论文，介绍了结合了STED、PLAM和STORM技术优势的MINFLUX超分辨率荧光显微镜 (也称为纳米显微镜) 。研究团队的实验实现了6纳米的分辨率，他们的目标是实现1纳米的分辨率，使生物学家不仅可看清病毒的结构，还可清晰地观察病毒感染细胞的整个过程，最终找到灭杀病毒的有效方法。
斯蒂芬·黑尔(Stefan Hell)和他的MINFLUX研究团队
共聚焦显微镜图像(上左)、受激发射损耗显微镜(STED)图像(上右)、超分辨率荧光显微镜(MINFLUX)图像(下)的对比
据最新报道，黑尔的MINFLUX团队又取得了新进展，实现了细胞中3D多色、优于1纳米分辨率的成像，题为“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”的论文2020年1月13日发表在Nature Methods。
黑尔MINFLUX研究团队取得的最新进展
双色3D MINFLUX纳米显微镜图像显示的细胞分布及蛋白质距离(上图)，传统显微镜图像(下图左)
生命体与成像设备分辨率的对应关系示意图
结 语
“阿贝极限”是恩斯特·阿贝 (Ernst Abbe) 1873年提出的。根据阿贝的理论，光的基本衍射性质决定了以可见光 (波长范围在0.38~0.78微米) 作为光源的光学显微镜无法实现0.2微米(约可见光波长的二分之一) 以下的分辨率。
在一代又一代科学家坚持不懈的努力之下，百余年之后的21世纪初，光学显微镜终于实现了“阿贝极限”的真正突破！超高分辨率的光学显微镜使科学家们能深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的整个动态过程，为人类攻克致病病毒提供了有力的工具。
“阿贝极限”的真正突破经历了百余年，衷心地向为此做出杰出贡献的科学家们表示深深的敬意！
本文经授权转载自微信公众号“中科院高能所”，图片源自网络。