质粒提取方法的基本原理

简介

许多分子生物学技术都需要高纯度和高浓度的质粒DNA作为基础。本章将讨论从细菌培养物中纯化质粒DNA的一般程序。有关如何在平板上划线以获得单个菌落和产生液体细菌培养物的详细信息可以参看之前推文。

一些商业公司，如Qiagen、Invitrogen和Promega，出售分离质粒DNA的试剂盒，其数量低至几mg至几mg，浓度范围为150ng/ml至几mg/ml。下面的方案旨在描述从细菌培养物中纯化质粒DNA的一般程序。如果要使用提取试剂盒，请按照试剂盒的说明书进行操作。如果想要在不使用试剂盒的情况下进行质粒纯化，可以参考本文的方案。

实验器材

台式微量离心机

台式涡流器

真空泵（可选）

实验试剂

用质粒转化的细菌过夜培养物

重悬缓冲液

变性溶液

复性溶液

2 mg/mL RNase A

TE或水饱和苯酚氯仿

氯仿

100%乙醇或异丙醇

90%乙醇

70%乙醇

TE缓冲液

3 M醋酸钠（pH值4.8）

操作步骤

一、DNA提取的一般步骤

1. 将含有质粒的细菌培养过夜。

注意：参考适当的DNA提取准备方案，以确定细菌的生长量（低拷贝质粒需要更多的细菌）。

2.在进行DNA制备之前，先离心培养物使细菌形成颗粒，沉淀。

提示：如果过夜培养物不能装入一个离心管中进行收集，那么可以将其等分放入数个管/瓶中离心，之后去除上清液并将细菌重新悬浮在缓冲液中。

注意：这一步需要完全重悬细菌，但最好使用能够与变性溶液完全反应的最小体系重悬。

3.向重悬的细菌中添加变性溶液。

注意：这一步会使细菌裂解，将其内含物（包括质粒DNA）释放到溶液中。

4.向变性细菌中加入复性溶液。

注意：这一步会使pH值下降，导致蛋白质和基因组DNA沉淀，同时使较小的质粒在溶液中游离。

5.离心分离蛋白质和基因组DNA，分离出含有质粒的上清液。

6.加入乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。

7.离心收集质粒沉淀或使用柱子结合沉淀的DNA。

8.用70%乙醇清洗质粒沉淀或柱子，以去除多余的盐。

9.重悬质粒，或使用水或中性缓冲液（如TE）从柱上洗脱DNA。

现在，你将拥有从细菌蛋白质和基因组DNA中纯化出来的质粒DNA。根据使用的方法，对DNA浓度和纯度的要求会有所不同。

二、无试剂盒碱性裂解提取微量质粒

准备以下溶液：

1.准备2ml含有质粒的细菌过夜培养物。

2.向2 mL离心管中添加1.5 mL细菌过夜培养物。10000 g，离心30秒。倒出上清液，注意不要倒出沉淀。

3.使用100μl预冷的溶液I，重悬细菌。涡旋2 min或直至所有细菌彻底重悬。

4.添加200μl溶液II，轻柔的将离心管颠倒5次，以混匀内容物。随着蛋白质和DNA的变性，内含物会变得清晰和粘稠。

注意：在此阶段请勿涡旋，否则基因组DNA将被切断，从而污染质粒DNA。

5.将溶液在冰上孵育5 min。

6.添加150μl预冷的溶液III。轻柔的颠倒几次混匀。将形成白色沉淀，其中包含细菌蛋白质和基因组DNA。

7.冰上孵育5 min。

8.12000 g，离心5 min。

注：沉淀中含有蛋白质、细胞碎片、盐和溶液中的其他额外沉淀。

上清液含有从细菌中分离的质粒DNA。

9.通过移液器或小心倾倒将上清液收集到新的离心管中。

10.（可选）向上清液中添加5μL 2 mg/ml RNase A，并在37°C孵育5 min。

注：RNase A是一种胰腺核糖核酸酶，可消化单链RNA。

11.（可选）进行苯酚-氯仿萃取。（见：三、DNA样品的酚氯仿提取）

注：苯酚-氯仿萃取去除DNA样本中残留的污染蛋白质和RNase A。当苯酚与含有DNA的水溶液混合时，蛋白质将进入苯酚相中，并与水相DNA分离。

12.向溶液中添加700μL预冷的100%乙醇或350μL室温异丙醇以沉淀质粒DNA。

注意：如果用乙醇沉淀，通常认为在-20°C或-80°C下孵育20 min或过夜可沉淀最大化。

13.弃上清液。

14.（可选）用70%乙醇清洗沉淀。（见：四、乙醇沉淀）

注：此步可去除沉淀中多余的盐离子，可避免一些常见反应出现问题。

15.将沉淀晾干20-30 min。

16.用25-50μl的TE重悬质粒。

三、DNA样品的酚氯仿提取

1.向含DNA样品的水相中加入等量的饱和苯酚氯仿。

注意：如果DNA重悬在水中可进行次步骤，DNA重悬在TE中则不可使用。

2.涡旋离心管30-60 sec。

3.室温，最高转速离心5 min。

注意：可见清晰分层。

顶相——DNA水相

中间相——可能出现白色层，由沉淀的蛋白质组成

底相——有机相（蛋白质）

4.用移液器吸取含DNA的水相，并转移至新离心管。

5.向含DNA的水相中加入等量的氯仿。

6.重复步骤2-4。

注意：苯酚-氯仿是一种危险废物-不要倒在水槽中。

四、乙醇沉淀

1.向DNA溶液中添加2-2.5倍体积的95%或100%乙醇和1/10体积的3M醋酸钠（pH值4.8）。颠倒离心管混匀。

2.（可选）在-20°C下过夜或-80°C下放置30 min。

注意：低温有助于DNA沉淀。

3.在4°C下高速（至少12000 rpm）离心，15-30 min。

注：沉淀中含有质粒DNA。

上清液含有残留物、盐离子和水。

4.弃上清液。在纸巾上打开并倒置管子，将多余液体排出。

5.添加500µl预冷的70%乙醇清洗沉淀。

注意：这一步有助于去除DNA沉淀中多余的盐离子。

6.在室温下高速（至少12000 rpm）离心，5 min。

7.弃上清。

注意：千万小心！在70%乙醇清洗后，沉淀更难看到，也更易脱离离心管。如果担心沉淀丢失，也可以用移液器将上清液从离心管中吸出。

8.用真空泵干燥或用纸巾倒置干燥5-20 min。

9.用TE（10 mM Tris-HCl pH 8，0.1 mM EDTA）或水重悬质粒DNA。

注意：DNA重悬需要时间，最好在室温下放置数小时至一夜，然后再进行定量和使用。

10.将DNA储存在4°C或-20°C下。以备后续实验。