江苏省农科院面源污染团队：微藻水热碳化还田实现养殖废水磷素高效回收利用和作物增产
微藻含有极为丰富的无机氮和磷，这些氮和磷以蛋白质和聚磷酸盐的大分子聚合物形式贮存于细胞内。例如小球藻（Chlorella），含氮量可高达7-12%，含磷量高达1-3%。这表明微藻有望作肥料为作物提供必需养分。然而，微藻脱水困难，以及含有氮磷的大分子在土壤中不易降解而阻碍了作物对养分的吸收。水热碳化技术可将微藻内大分子聚合物通过水热反应水解后而变为更容易在土壤中降解的小分子，更有利于植物吸收利用。江苏省农业科学院农业环境与面源污染治理团队冯彦房副研究员等人在废弃物水热碳化技术（HTC）方面开展了系列研究和应用。为此，本团队尝试将微藻通过水热碳化技术，以实现养分资源的循环利用。相关研究结果分别发表在J Cleaner Production (2021) 和Sci Total Environ (2020)。具体介绍如下。
实验1：养殖废水培养微藻并通过水热碳化将磷转化为缓释磷肥循环到作物-土壤系统
磷是维持作物生长的最重要的养分之一。依照现有的磷肥使用和人口增长趋势，地球上的磷矿石储量将在50-100年内耗尽。将污水中的磷循环到农业中为作物生长提供磷营养是一个解决环境污染和磷矿石储存有限的可能方案，同时响应了国家“减肥增效”行动的号召。尽管一些污水或污水底泥含磷量很高，但往往不宜直接用于农业灌溉或施肥。用绿色低成本的方法将污水中的磷回用到农田中，是一个值得研究的问题。
水热碳化法(hydrothermal carbonization)是指在一个密闭的体系中，以碳水化合物或木质纤维素为原料，以水为反映媒介，在一定温度（130-250°C）及自产生的压力下，原料经过一系列复杂反应而转化成生物炭(hydrochar)材料的过程。由于在密闭体系中发生水热反应且水体pH可控，促使聚磷酸盐和有机磷既能彻底水解又可以避免碳氮的气化损失，因而实现了生物炭的高产出。不仅如此，水热法制作的生物炭也具备养分缓释和固持的特性。通过水热碳化制成的微藻类生物炭含有较多的表面官能团（包括羧基，羟基，酚羟基等），而且具有庞大的比表面积和高有机质含量，这些特性可以增加对土壤养分的吸附固持，有利于养分的固持和缓释，既防止了养分的淋失又满足了植物对养分的长期需求，这是直接施肥法和发酵堆肥法都无法实现的。水热生物炭的这一特性也避免了传统化肥中过快释放的磷在不能被植物所利用后通过地表径流或淋失到地下水的损失问题，提高了磷的利用效率。
因此，本研究旨在实现以微藻为媒介，辅以水热碳化的技术，将磷从污水中循环到农田作物中。具体工作包括调查磷从污水向土壤-作物体系循环过程中质，量和形态的转化，以及筛选出最优的可以提高作物磷利用率的可作为缓释磷肥的微藻水热炭。
将微囊藻和小球藻分别在富含磷的养鸡场污水中培养，然后将富集了废水中磷的微藻絮凝，再将这些鲜藻与去离子水或者1%柠檬酸溶液以1:1-4 (w/v)的比例混合；将这些混合物置于高压反应釜中，分别在200℃和260℃及其自然生成的压力下（约为5-10MPa）水热碳化2小时，得到四种小球藻水热炭材料，包括CVHCA200（在200 °C和以去离子水为反应介质），CVHCA260（在260 °C和以去离子水为反应介质），CVHCA200: 在200 °C下以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制；CVHCA260: 在260 °C下以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制。四种微囊藻水热炭材料，包括MSHW200（在200 °C和以去离子水为反应介质烧制），MSHW260：在260 °C以去离子水为反应介质烧制；MSHCA200: 在200 °C下以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制；MSHCA260: 在260 °C下以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制。对制备的微藻水热炭磷含量和形态进行分析，并通过土壤培养实验和小麦盆栽实验观察土壤磷形态、土壤理化特征和小麦生长情况。
（1）微藻的生长和污水中磷的去除效率
如图1所示，两种微藻在培养两周后生物量均达到最大，其中微囊藻在磷的去除效率和生物量积累上都明显优于小球藻，其中生物量达到1.17 g L-1，去除了污水中88.4%的磷，对污水中总磷的去除速率达到2.65 mg L−1 day−1。
图1. 小球藻（CV）和微囊藻（MS）在养殖场废水中的生长曲线和磷去除效率。
（2）水热炭的磷含量
结果显示，水热碳化导致了水热炭中磷浓度的增加。4种小球藻中的磷浓度为3.2%-4.7%，这比原始的小球藻高出23.1%-67.9%。4种微囊藻中的磷浓度为3.9%-6.2%，这比原始的微囊藻高出14.7-72.2%。微囊藻水热炭中的磷明显高于小球藻水热炭，这主要是因为微囊藻在污水中富集的磷含量较高。
随着反应温度从200升高到260°C，小球藻水热炭，微囊藻水热炭中的磷含量明显增加，但是水热炭的产量显著下降。高温下水热炭产量的下降可能和水热反应过程中聚合物的水解有关，随着温度升高，越来越多的有机质降解溶解到了热解液中，从而导致了固体产率的下降。值得注意的是，使用柠檬酸作为反应介质下水热炭的产率达到了41.1-62.0%，而使用去离子水仅有32.3-46.3%。而且，对小球藻而言，CVHCA200和CVHCA260的磷含量比 CVHW200和CVHW260高出9.4-27.0%，对微囊藻而言，MSHCA200和MSHCA260的磷含量比MSHW200和MSHW260高出21.6-28.2%。不仅如此，在小球藻和微囊藻中最高的磷恢复率都在柠檬酸为介质制得的水热炭中，CVHCA260的磷回复率达到72.3%，MSHCA260的磷回复率达到了91.5%。
（3）水热炭中磷含量分析
对水热炭中磷次序提取的结果显示在图2，值得注意的是，原始藻中有效磷的浓度（包括溶解态和离子交换态）分别为34%（小球藻）和27.9%（微囊藻），但是在水热炭中均不到20%（例如MSHCA260中仅为8.8%）。然而，经常被视为缓释磷库的铁铝结合态磷在水热炭中显著增加，成为占比最高的磷形态，约占据32.8-52.7%。值得注意的是，使用柠檬酸作为反应介质可以显著的增加水热炭中的缓释磷库。在CVHCA260和MSHCA260中，铁铝结合态磷分别占据了46.2%和51.5%。
图2. 原始微藻CV和MS，以及八种水热炭中磷分级的结果
（4）磷从微藻水热炭向土壤-作物体系中的释放
土壤培养实验显示了表明施加化肥后30天土壤中有效磷含量远高于MS和MSHCA260处理，但是30天之后，MS和MSHCA260的缓释磷性能发挥作用，土壤磷浓度持续升高，超过了化肥的作用，两者相比之下MSHCA260的缓释性能更强。化肥在早期释放了高浓度的有效磷，但随着时间推移慢慢的淋失或者被微生物同化，可能无法被植物长期利用。而拥有缓释磷特性的MSHCA260更有利于为作物提供长久有效的磷。
进一步的盆栽实验表明，在分蘖期，相比于化肥对照，小球藻，微囊藻，CVHCA260和MSHCA260显著地减少了土壤中4.9，3.8，3.5和3.6倍的溶解态磷，以及47.4%，82.6%，80.5%和68.3%的交换态磷。但是，在成熟期观察到了完全相反的趋势。成熟期有效磷的增加暗示了水热炭可以长期有效的向植物中输送磷营养。铁铝缓释磷库的变化趋势也与有效磷库的变化完全相反，暗示了水热炭通过增加土壤缓释磷库而实现了缓释磷的作用。
随着小麦从分蘖期到成熟期，CVHCA260和MSHCA260处理下根际土中可被作物直接利用的磷，溶解态磷和交换态磷的浓度逐渐升高，而化肥对照中出现了相反的结果（图3）。这些结果说明了随着小麦的生长和时间的推移，对照组中最初施加的磷化肥中的有效磷逐渐减少，这些减少的有效磷在没有被小麦吸收利用之前已经淋失或者被土壤微生物同化而不能持续的被植物吸收。相对而言，水热炭缓释磷肥的有效磷含量虽然低于磷化肥，但是水热炭中的磷可以缓慢释放入土壤中供小麦长期利用。这种缓释作用满足了小麦生长的长期需求。另外，水热炭还促进了土壤碱性磷酸酶的活性，这可能是因为水热炭中含有丰富的小分子有机物，这些可以促进微生物的活性并释放出一些活性酶，其中就包括了磷酸酶。
因此，微囊藻水热炭实现了缓释磷肥的作用，相比于化肥而言促进了小麦对磷肥的利用效率。相比于化肥对照组，MS没有显著提高磷利用率，而MSHCA260处理的小麦磷肥利用率显著增加了34.4%。同时，也只有MSHCA260显著增加了小麦产量，相比于化肥提高了21.4%。这两个积极结果证明了本项发明可以实现以微囊藻为媒介将污水中的磷转移到农田中来提高作物的磷肥利用率，以水热碳化的方法制作缓释磷肥实现对磷化肥的替代和农田的减磷增效，从而缓解磷肥原料不足以及磷流失造成的环境污染的双重问题。
本次研究验证了一种通过微藻为媒介将污水中的磷循环到农田中的方法。微囊藻可以在14天内将污水中88.4%的磷移除，然后将微藻中91.5%的磷转移到水热炭中，同时施入土壤中有效的增加了铁铝结合态的缓释磷库，实现了满足作物长期磷需求的缓释肥作用，相比于传统化肥提高了34.4%的磷利用率，并且提高了21.6%的产量。这些发现对可持续农业而言有着积极的双重功效，既节省了污水处理的费用，又变废为宝制出了可以缓解磷矿石不足的缓释磷肥。
实验2：微藻水热炭提高了水稻产量但增加了稻田气态氮损失风险
虽然微藻水热炭还田可实现磷的高效循环利用，但是对气态氮损失和作物产量的影响值得关注。稻田气态氮（NH3和N2O）损失是重要的N素损失方式。如实验一所述，水热碳化技术有助于将微藻转化为炭基肥料，同时要注意大量的含氮物质可能会引起农田中氨挥发和氧化亚氮的排放。一旦进入稻田的氮超出了植物的需求，便有可能气化逸出农田，从而导致面源污染或温室效应。因此，本次研究旨在调查水热碳化技术是否能将富营养化水体的微藻，变废为宝转变为作物的氮源，同时考察微藻水热炭对稻田氨挥发和氧化亚氮排放的影响。
本实验将培养的小球藻置于水热反应釜中，增温至260°C，压力为8Mpa下，以固液比1:10的条件下反应一小时。其中，按照反应液相介质不同，编号为CVHW（反应介质为去离子水）和CVHCA（反应介质为质量分数1%的柠檬酸）；另取冻干小球藻磨成粉（粒径< 2mm）记为CVP，将三种材料施加入土壤中并监测NH3和N2O的排放。
研究表明，CVHW和CVHCA都显著增加了水稻的产量以及氮素的利用率，相比于对照，两种处理的水稻籽粒产量分别提高了26.7%和21.2%，将氮利用率分别提高了48.7%和49.6%。而且，相似的提升趋势也体现在收获指数和籽粒的溶解性糖的方面。这些表明了水热碳化法是一个有效的将微藻转化为氮肥的方法。一个重要的原因在于水热炭显著增加了土壤铵态氮的固持。与对照相比，三种材料显著增加了氨挥发的排放量。基肥时期内，CVHCA与对照组，CVP和CVHW相比，氨挥发分别显著增加了2.29，1.51和1.30倍；在第一次追肥后的一周内，相比于化肥对照组和CVHW，CVHCA显著增加了61.7%和62.6%，且CVHCA显著地增加了42.4%的单位产量氨挥发（图3）；CVHW和CVHCA的N2O排放峰值都出现在移栽后的45天；CVHCA氧化亚氮排放总量最高，与对照，CVP和CVHW相比，分别增加了3.20，1.46和1.47倍（图4）。
微藻水热炭显著的增加了土壤铵态氮浓度（图5），氨挥发量以及氧化亚氮的排放，和水稻氮素的吸收。微藻水热炭中较高的氮含量（7.25-12.29%），不仅为植物也为土壤微生物提供了一个巨大的氮源，同时微藻水热炭作为一个低碳氮比的有机质投入到了土壤中，这会显著加速土壤中有机氮素的矿化。本研究的结果证明了使用去离子水或者柠檬酸作为水热反应介质，可以将小球藻转化为一种高效的氮肥，不仅提高了水稻籽粒的产量，而且增加了水稻氮的利用率以及籽粒中的溶解性糖含量，但同时又增加了氨挥发和氧化亚氮的损失。本实验使用的小球藻水热炭，可作为一种高效的氮源，如果将富营养化水体中的微藻转化为水热炭，可以起到将氮从污染中的水体循环到农田的作用；但若不考虑肥料替代效应，也可能带来面源污染和温室效应。未来将从肥料替代角度进一步分析微藻水热炭还田对气态氮损失的影响。
图3. Control（化肥对照）；CVP（小球藻）；CVHW (以去离子水为反应介质烧制的小球藻水热炭)和CVHCA（以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制的小球藻水热炭）对三次肥期水稻土动态氨挥发（A）；氨挥发总量（B）；以及单位产量氨挥发损失的影响（C）。
图4. Control（化肥对照）；CVP（小球藻），CVHW (以去离子水为反应介质烧制的小球藻水热炭)和CVHCA（以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制的小球藻水热炭）对水稻生长期内氧化亚氮动态排放（A）；氧化亚氮总量（B）；以及单位产量氧化亚氮排放的影响（C）。
图5. Control（化肥对照）；CVP（小球藻），CVHW (以去离子水为反应介质烧制的小球藻水热炭)和CVHCA（以1%柠檬酸溶液为反应介质烧制的小球藻水热炭）对三个肥期时土壤铵态氮（A）和硝态氮（B）的影响。
致谢：
相关研究获得了国家自然科学基金（41877090、41807099）、国家重点研发计划课题（2018YFD0800206）以及江苏省农业自主创新（CX(19)1007）等科研项目的支持，在此表示感谢。同时感谢参与部分采样分析工作的研究生和实习生。
相关文献：
[1] Chu, Q., Lyu, T., Xue, L.*, Yang, L., Feng, Y., Sha, Z., Yue, B., Mortimer, R.J.G., Cooper, M., Pan, G.* 2021. Hydrothermal carbonization of microalgae for phosphorus recycling from wastewater to crop-soil systems as slow-release fertilizers. Journal of Cleaner Production, 283, 124627.
[2] Chu, Q., Xue, L., Cheng, Y., Liu, Y., Feng, Y.*, Yu, S., Meng, L., Pan, G., Hou, P., Duan, J., Yang, L. 2020. Microalgae-derived hydrochar application on rice paddy soil: Higher rice yield but increased gaseous nitrogen loss. Science of The Total Environment, 717, 137127.