一种防治肝损伤的中药组合物的制作方法

本发明涉及医药 
技术领域：
，特别是涉及一种用于防治肝损伤的中药组合物。
背景技术：
：肝损伤所引起的肝脏疾病已成为困扰全球医疗领域的一个重要问题。肝损伤包括化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤和酒精性肝损伤等类型。其中最常见的是酒精性肝损伤，酒精性肝损伤(ALD)是由于长期大量饮酒所致的肝脏疾病，初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死甚或肝功能衰竭。目前ALD的发病机制并不十分清楚，自由基及其介导的脂质过氧化被认为是最主要的致病因素。乙醇在肝脏代谢时可产生大量自由基：O2-、H2O2、OH-、C2H5O-和C2H5OH-，过量的自由基可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常；大量肝细胞内酶(ALT、AST)释放入血，并可使清除自由基酶(SOD、GPx)耗竭，肝细胞损伤进一步加重，肝功能异常，脂肪代谢紊乱，最终导致肝细胞广泛坏死，细胞肿胀死亡。因此，清除自由基抑制脂质过氧化反应，保护肝细胞，恢复肝脏正常功能，是防治ALD发生和发展的关键。至今临床上还没有有效防治酒精性肝损伤的理想药物，因此市场上亟需安全有效、作用机制明确的抗酒精性肝损伤药物。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种治疗肝损伤的中药组合物。本发明以解酒毒、清湿热，疏肝胆，行积滞，化痰结，通过增强肝脏解毒和酶解，以利尿作用加速体内乙醇的分解和排泄，阻止消化道对乙醇的吸收及中枢神经系统的作用，降低乙醇对肝脏的损害，促肝细胞再生，增加脑及冠状血管流量，缓解中毒症状为目的来组方。葛根用于解酒有长期的临床积累，金·张从正《儒门事亲》中即收载有解酒名方“葛根散”。现代药理研究表明，它对酒精的吸收和代谢均有影响，可经由抗氧化、保肝、保护中枢神经系统等途径发挥解酒作用。女贞子中含有多种保肝活性成分：三萜类成分如齐墩果酸、乙酰齐墩果酸、熊果酸等；环烯醚萜类化合物如女贞苷、特女贞苷、10-羟基女贞苷、新女贞子苷等；苯乙醇-苷类化合物如对羟基苯乙醇-β-D葡萄糖苷(红景天苷)；女贞子多糖等。这些有效物质通过清除氧自由基和抗肝纤维化来保护肝脏。枳椇子有清热利尿，解酒毒之功效，主治酒毒、烦热、口渴、呕吐、二便不利等症。民间素有“千杯不醉枳椇子”的说法，古代医书《医方考》中亦有记载“枳椇子(鸡距子)，解酒，过于葛花。枳椇子可加快乙醇代谢，降低酒后血醇浓度，增强肝脏乙醇脱氢酶活性，降低肝脏脂质过氧化风险，减少乙醇所致肝损伤等。五味子含有五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等木脂素类成分，这些成分是其保肝作用的主要物质基础，具有改善肝功能、减轻肝细胞脂质过氧化损伤，从而防止肝纤维化的作用。其中五味子乙素可减轻H2O2导致的人肝细胞氧化损伤。枸杞子，其名出自《神农本草经》，味甘、性平，可用于治疗因肝肾不足、肺肾亏虚所致诸症。其枸杞多糖对于肝脏具有很好的保护作用。栀子味苦、性寒，有泻除烦、清热利湿、凉血解毒的功效，是临床常用的保肝利胆药。本发明的技术方案如下：一种防治肝损伤的中药组合物，以葛根提取物、女贞子提取物、枳椇子提取物、五味子提取物、枸杞子提取物、栀子提取物为原料制备而成，其重量配比为葛根提取物80-120份，女贞子提取物40-60份，枳椇子提取物40-60份，五味子提取物24-36份，枸杞子提取物24-36份，栀子提取物24-36份；进一步优选为葛根提取物100份，女贞子提取物50份，枳椇子提取物50份，五味子提取物30份，枸杞子提取物30份，栀子提取物30份。葛根提取物：取葛根，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。女贞子提取物：取女贞子，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。枳椇子提取物：取枳椇子，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。五味子提取物：取五味子，加75～85％乙醇加热回流提取两次，合并提取液，滤过，浓缩，干燥，即得。枸杞子提取物：取枸杞子，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。栀子提取物：取栀子，加水煎煮两次，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。本发明还包括以上述中药组合物添加适宜的药用辅料制成的固体制剂，剂型为片剂、胶囊或颗粒剂。本发明还包括上述中药组合物及其制剂在制备防治肝损伤药物中的应用。上述中药组合物经过连续30天经口灌胃给予雌性SD大鼠后，可见动物生长发育正常。在酒精性肝损伤模型成立的基础上，中、高剂量组能显著降低大鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛含量(P＜0.01、P＜0.05)；中、高剂量组大鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽含量升高有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01)；各剂量组甘油三酯含量与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。中、高剂量组的脂肪染色评分降低有显著性差异(P＜0.01，P＜0.01)，组织病理学检查结果为阳性。上述组合物对雌性SD大鼠具有酒精性肝损伤的辅助保护功能。具体实施例实施例1对酒精性肝损伤的保护作用1.实验方法1.1样品：取下表中的提取物，混合均匀，备用。试验时用蒸馏水作溶剂配制受试物，冷藏保存。配方配方重量(Kg)葛根提取物10女贞子提取物5枳椇子提取物5五味子提取物3栀子提取物3枸杞子提取物3各提取物的制备方法如下：葛根提取物：取葛根，加8倍重量的水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。女贞子提取物：取女贞子，加8倍重量的水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。枳椇子提取物：取枳椇子，加8倍重量的水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。五味子提取物：取五味子，加8倍重量80％乙醇加热回流提取两次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，浓缩，干燥，即得。枸杞子提取物：取枸杞子，加8倍重量的水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。栀子提取物：取栀子，加8倍重量的水煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥，即得。1.2实验动物：由四川省中医药科学院实验动物中心提供的雌性SD大鼠50只，体重181-220g，生产许可证号为SCXK(川)2013-19.SPF级。动物饲料由四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所提供，生产许可证号：SCXK(川)2015-01。实验动物房使用许可证号为SYXK(川)2016-043.屏障系统，温度为20-25℃，相对湿度40-70％。1.3剂量选择及受试物给予方式：将雌性SD大鼠随机分为五组，每组10只，试验设267mg/kg.BW、800mg/kg.BW、1600mg/kg.BW三个剂量组(分别相当于人体每日推荐量的5、15、30倍)，分别称取6.68g、20.00g、40.00g受试物，依次加蒸馏水至250ml混匀备用，用完再配。另设蒸馏水对照组和50％乙醇模型对照组。用乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，灌胃量14ml/kg.BW(折合乙醇的剂量为7000mg/kg.BW)。按10ml/kg.BW每天经口灌胃一次，连续给予30天，每周称两次体重，以此调整给药量。1.4试验方法：采用酒精性肝损伤模型法，三个剂量组给予不同剂量的受试物，阴性对照组和模型对照组给予蒸馏水。试验结束时将模型对照组和三个剂量组一次经口灌胃给予50％乙醇溶液，剂量为14ml/kg.BW，阴性对照组给予同体积的蒸馏水，禁食16h后处死动物取肝脏称重，计算脏体比，并用肝脏进行生化指标检测及组织病理学检查。2.检测指标2.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及甘油三酯(TG)的测定：MDA和GSH测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，用上海天美科学仪器有限公司生产的UV1100分光光度计测定；TG测定试剂盒由德国奥林巴斯(欧洲)诊断有限公司提供，用日本奥林巴斯光学株式会社生产的AU-400全自动生化分析仪进行测定。2.2肝脏称重及脏器系数的计算2.3肝脏组织病理学诊断标准2.3.1病理观察材料：从动物肝左叶中部做横切面取材、切片、染色、镜下观察脂滴在肝脏中的分布、范围和面积。2.3.2病理观察方法：每例动物肝组织用40倍物镜连续观察组织切片，根据阳性细胞多少和分布的范围，按0、1、2、3、4分进行评分。将所得分数的平均值作为该例肝组织的脂肪染色评分。2.3.3病理诊断标准：病理组织学观察以肝细胞脂滴染色作为观察指标，并根据病理改变程度“0”、“1”、“2”、“3”、“4”量化，进行肝损伤程度的评价。2.3.4肝细胞脂肪染色共分为五级：2.4试验数据统计：试验数据统计采用SPSS11.0forwindows软件包处理。对照组与各剂量组的数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05，则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett，sT3法进行两两比较。阴性对照组与模型对照组数据则采用T检验。2.5结果判定：肝脏MDA、还原型GSH和TG三项检测指标结果阳性或肝脏MDA、还原型GSH和TG三项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。满足以上任一条件，可判定该受试样品具有对酒精性肝损伤有辅助保护作用。3.试验结果3.1对大鼠体重、肝重、肝体比的影响由表1可见，各剂量组大鼠的初始体重与阴性对照组及模型对照组比较，方差齐(P＞0.05)，方差分析结果(P＞0.05)，说明各组动物初始体重是均衡的。模型对照组的中期体重、终重、肝重、肝体比与阴性对照组比较，除肝重、肝体比显著升高(P＜0.01，P＜0.01)外，其余指标无显著性差异(P＞0.05)。各剂量组动物的中期体重、终重、肝重及肝体比与模型对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)。表1对大鼠体重、肝重、肝体比的影响注：ΔΔ表示与阴性对照组比较P＜0.01。3.2对大鼠肝匀浆中MDA、GSH、TG含量的影响由表2可见，模型对照组大鼠肝匀浆中的MDA、GSH、TG含量与阴性对照组比较，经t检验，MDA、TG含量显著升高(P＜0.01、P＜0.01)，GSH含量显著降低(P＜0.01)，表明该模型是成功的，实验系统可靠。三个剂量组的MDA、GSH、TG含量与模型对照组比较，可见中、高剂量组的MDA显著降低(P＜0.01、P＜0.05)，中、高剂量组的GSH显著升高(P＜0.05、P＜0.01)，各剂量组TG均无显著差异(P＞0.05)。表2对大鼠肝匀浆中MDA、GSH、TG含量的影响注：ΔΔ表示与阴性对照组比较P＜0.01；*表示与模型对照组比较P＜0.05；**表示与模型对照组比较P＜0.01。3.3肝脏组织病理学检查结果结果见表3，模型对照组大鼠的肝细胞脂肪染色评分与阴性对照组比较，升高有极显著性差异(P＜0.01)，表明该模型是成功的，实验系统可靠。三个剂量组大鼠的肝细胞脂肪染色评分与模型对照组比较，中、高剂量组降低有显著性差异(P＜0.01，P＜0.01)。表3对大鼠肝脏组织病理学检查结果注：ΔΔ表示与阴性对照组比较P＜0.01；**表示与模型对照组比较P＜0.01。4.小结：连续30天经口灌胃给予雌性SD大鼠后，可见动物生长发育正常。在酒精性肝损伤模型成立的基础上，中、高剂量组能显著降低大鼠肝匀浆中的过氧化脂质降解产物丙二醛含量(P＜0.01、P＜0.05)；中、高剂量组大鼠肝匀浆中的还原型谷胱甘肽含量升高有显著性差异(P＜0.05、P＜0.01)；各剂量组甘油三酯含量与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。中、高剂量组的脂肪染色评分降低有显著性差异(P＜0.01，P＜0.01)，组织病理学检查结果为阳性。即该组合物对雌性SD大鼠具有酒精性肝损伤的辅助保护功能。实施例2安全性评价试验1.实验方法1.1样品：实施例1样品。试验时用蒸馏水作溶剂配制受试物，冷藏保存。1.2实验动物：1.2.1饲养环境及饲料来源：试验动物房使用许可证号为SYXK(川)2011-043.屏障系统，温度20-25℃，相对湿度40％-70％。饲料来源于四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所，生产许可证号为SCXK(川)2015-01。1.2.2动物：相关试验动物使用情况见表4。表4实验动物一览表1.3剂量选择与受试物给予方式：1.3.1急性经口毒性试验：设15000mg/kg.BW一个剂量组，按20ml/kg.BW经口灌胃。灌胃前动物禁食16h，不限饮水，首次染毒后观察7天。1.3.2Ames试验：设8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组及溶剂对照组(蒸馏水)、自发对照组和阳性对照组。1.3.3骨髓细胞微核试验：设2000mg/kg.BW、4000mg/kg.BW、8000mg/kg.BW(一次最大灌胃量)三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)对照及环磷酰胺阳性对照组(CP，40mg/kg.BW)。按20ml/kg.BW经口灌胃，两次间隔24h，首次染毒后观察30h。1.3.4精子畸形试验：设2000mg/kg.BW、4000mg/kg.BW、8000mg/kg.BW(一次最大灌胃量)三个剂量组，另设溶剂(蒸馏水)对照组和环磷酰胺阳性对照组(CP，40mg/kg.BW)。每天按20ml/kg.BW经口灌胃，连续5天，首次染毒后观察35天。1.3.530天喂养试验：设1333mg/kg.BW、2667mg/kg.BW、5333mg/kg.BW三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的25、50、100倍)，另设全价颗粒饲料对照组。采用拌饲法，首次染毒后观察30天。1.4主要试剂：生化试剂盒、环磷酰胺、1，8-二羟基蒽醌、叠氮化钠、2-氨基芴、4-硝基喹啉-N氧化物、丝裂霉素C、S-9混合液。1.5试验方法：1.5.1急性经口毒性试验：采用最大耐受剂量法，大、小鼠分别随机分成两组，共4组，每组同系同性10只动物。称取75g受试物加蒸馏水至200ml混匀后备用。大、小鼠二次给予受试物，间隔4h。观察一周内动物的中毒表现及死亡情况，试验结束称体重后处死动物作大体解剖。1.5.2Ames试验：使用经β-萘黄酮与苯巴比妥联合诱导雄性大鼠肝S9，按标准方法制成S9混合液后作为活化系统，用间接致突变物(20μg/皿2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100，50μg/皿1，8-二羟基蒽醌用于TA102菌)测定S9活性。试验采用TA97、TA98、TA100、TA102四种菌株，受试物设8、40、200、1000、5000μg/皿五个剂量组及溶剂对照组(蒸馏水)、自发对照组和阳性对照组。首先配制受试物工作液：准确称取5.0g样品，加蒸馏水至100ml混匀即为最高工作浓度50mg/ml，试验时取该工作液100μl加入平皿即为最高受试物终浓度(5000μg/皿)，以最高浓度为基础用蒸馏水5倍往下稀释即得以下浓度。0.103MPa20min高压蒸汽灭菌。在加和不加S9的试验条件下进行平板掺入法试验。每组作三个平行皿，重复试验一次。-S9阳性对照物：TA97和TA98用0.5μg/皿的4-硝基喹啉-N-氧化物；TA100用1.5μg/皿的叠氮化钠(NaN3)；TA102用1.0μg/皿的丝裂霉素C(MMC)；+S9阳性对照物TA102用50μg/皿的1，8-二羟基蒽醌，其余三个菌株均采用20μg/皿的2-氨基芴(2-AF)。每皿加入阳性对照的体积为0.1ml。1.5.3骨髓细胞微核试验：采用30h两次给药法，将小鼠按雌雄分别随机分为5组，每组5只动物，称取2.0g、4.0g、8.0g样品分别加蒸馏水至20ml，另称取0.04gCP加蒸馏水至20ml，混匀即可，两次灌胃间隔24h，于第二次给受试物后6h脱颈椎处死动物，取胸骨髓按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的规定进行制片，固定，Giemsa染色后，在油镜下每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞(PCE)中含微核的PCE数，计算微核细胞率(‰)。观察200个红细胞中嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/NCE)。1.5.4精子畸形试验：将小鼠随机分为5组，每组5只动物，称取8.0g、16.0g、32.0g样品分别加蒸馏水至80ml，另称取0.04gCP加蒸馏水至20ml(环磷酰胺每天临用时配制)，混匀即可。连续灌胃5天，于首次给受试物后第35天，脱颈椎处死动物取双侧附睾进行制片，按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的规定，甲醇固定，1％伊红染色后，在高倍镜下每只动物计数1000条完整精子，记录精子畸形、畸形类型及计算精子畸形率。1.5.530天喂养试验：采用拌饲法，将大鼠随机分成4组，每组20只大鼠，雌雄各半。配制含受试物的饲料各14kg，分别称取约187g、373g、747g受试物，先依次加入到3kg饲料中，因高剂量组受试物含量超过5％，用186g干酪素补充蛋白质，充分搅拌混匀后，将所剩饲料加入其中至总量14Kg，再充分搅拌混匀后，加工成型，钴60照射后备用。每天每只大鼠单笼喂养，连续30天，每天观察动物的一般表现、行为、中毒表现及死亡，每周计算两次进食量，并称一次体重，根据食物摄入量，计算食物利用率，试验结束时禁食后麻醉取血处死动物，采血用XT-2000i型全自动血细胞分析仪测定血液学指标，用日本奥林巴斯光学株式会社生产的AU-400全自动生化分析仪及德国奥林巴斯(欧洲)诊断有限公司提供的试剂盒，测定血生化指标，解剖动物观察内脏改变，称肝、肾、脾、睾丸重，计算其脏体比，取肝、肾、脾、胃肠、睾丸(卵巢)作组织病理学检查。试验期间动物自由进食、饮水。1.6试验数据统计：骨髓微核试验采用卡方检验，精子畸形试验采用秩和检验，30天喂养试验数据经方差齐性检验，方差齐，进行方差分析，如P值小于0.05则用Dunnett法进行两两比较；若方差不齐，则进行数据转换，仍不齐，改用秩和检验，如P值小于0.05，则用Dunnett’sT3法进行两两比较，上述统计均用SPSS11.0forWindows软件处理。1.7结果判定：1.7.1急性经口毒性试验：根据LD50数值，判定受试物的毒性分级。1.7.2Ames试验：受试物组回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以未处理对照数)，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验阳性。1.7.3骨髓细胞微核试验：试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。1.7.4精子畸形试验：每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行比较，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系，即可判定为阳性。2.实验结果2.1对大、小鼠急性经口毒性试验结果MTD值均＞15000mg/kg.BW，按急性毒性分级，属无毒级。2.2三项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验)结果未见致突变作用。2.330天喂养试验，可见动物生长发育正常，体重持续增长，体态活泼，被毛光滑柔顺，大、小便未见异常改变。试验期间未见动物出现中毒症状及死亡。三个剂量组雌雄大鼠的每周体重、每周进食量、每周食物利用率、总食物利用率、脏体比值、血液学指标及末期血生化指标检测结果与对照组比较，高剂量组第4周进食量显著降低(P＜0.05)，高剂量组的谷丙转氨酶显著降低(P＜0.05)，低中高剂量组总胆固醇显著降低(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)，雄鼠低、高剂量组的白细胞和高剂量组的淋巴细胞显著降低(P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01)，高剂量组的中性显著升高(P＜0.05)，高剂量组白蛋白显著升高(P＜0.01)，中剂量组尿谷草转氨酶显著降低(P＜0.05)。以上所测值均在本室正常值范围内。组织病理学检查结果，除动物自发病变外，未见受试物高剂量组引起动物中毒性损伤改变。实施例3胶囊剂原辅料名称配方量(g)葛根提取物100女贞子提取物50枳椇子提取物50五味子提取物30栀子提取物30枸杞子提取物30硬脂酸镁2制成1000粒制备方法：取上述6种提取物，混合均匀，干法制颗粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，装入胶囊，即得。实施例4颗粒剂原辅料名称配方量(g)葛根提取物1000女贞子提取物500枳椇子提取物500五味子提取物300栀子提取物300枸杞子提取物300麦芽糊精3600g甘露糖醇1500g制成1000袋制备方法：将麦芽糊精、甘露糖醇、葛根提取物、女贞子提取物、枳椇子提取物、五味子提取物、栀子提取物、枸杞提取物加入湿法制粒机，以85％乙醇溶液为润湿剂制备颗粒，颗粒干燥后整粒，装袋，即得。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3