TUNEL法实验原理及步骤

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

TUNEL操作流程图：

TUNEL实验步骤

1）、清洗：移去完全培养基，用 PBS 清洗一次细胞。

2）、固定：用 4％的多聚甲醛在室温固定 15 分钟。

3）、清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。

4）、破膜：用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室温通透化处理 15 分钟。

5）、清洗：用 PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。

6）、封闭：用含 5%山羊血清（BSA）的 PBS 在室温封闭 1 小时。

7）、清洗：TBST室温漂洗三次，每次10分钟。

8）、TUNEL溶液配制：Enzyme Solution和Label Solution以1：10混匀，避光备用，注意试剂用量，试剂盒价格昂贵，避免浪费。

9）、标记：用上诉配好的溶液，约20ul每张玻片，室温避光孵育10分钟，

10）、清洗：用PBS在室温漂洗三次，每次 10 分钟。

11）、DAPI染核：加入 DAPI 染色液 1：2000 室温孵育 5 分钟。

12）、清洗：用PBS 在室温漂洗三次，每次 10 分钟。

13）、封片：用封片剂封片，在荧光显微镜下观察结果，免疫荧光照片用蔡司共聚焦显微镜。

14）、TUNEL positive dot 计算方法：DAPI和TUNEL positive dot 通过image pro软件，计算DAPI的阳性点作为细胞总数，TUNEL阳性点作为tunel点，最后计算 TUNEL/DAPI×100%作为凋亡细胞的比率。