既往检验结果存在较大差异，检验科能够给予临床哪些提示？
患者，女性，53岁。2017年2月因“脾大6年，紫癜一年”入院。患者于6年发现脾脏大，长约50mm，未予特殊处理。1年前出现双下肢紫癜，臀部以下为主，为褐色紫癜，夜间睡眠、受热时可出现皮肤瘙痒。近期紫癜明显增多且范围变大，伴颜面部水肿，腹泻与便秘交替，2016年11月30日普宁市人民医院查血常规提示淋巴细胞升高，类风湿因子升高，为求诊治来我院，门诊收入血液内科。
既往史：有小三阳病史20余年，未予特殊处理，6年前因子宫肌瘤行子宫切除术，有输血史，有间断头痛、脑梗塞，有颈椎病、腰椎病，有肝囊肿、胆囊息肉病史，有鼻炎、咽喉炎病史，有十二指肠球炎病史，否认高血压病、心脏病、糖尿病史，否认结核、血吸虫等传染病史，有青霉素、阿奇霉素过敏史，具体表现不详。
体格检查：体温：36.6℃，脉搏：80bpm，呼吸：20bpm，血压：109/72mmHg，神清，查体合作，全身皮肤巩膜无黄染，臀部以下皮肤可见褐色紫癜，右侧腹股沟区可触及一1.0X1.5cm肿大淋巴结，质稍硬，可推动，有压痛，双肺呼吸音清，未闻及干湿性啰音，心律齐，HR80次/分，各瓣膜区未闻及病理性杂音，腹膨隆，肝肋下未及，脾脏高度肿大，第I线10cm，II线15cm，III+4cm，有压痛，双侧肾区无叩痛，移动性浊音（-），肠鸣音减弱，无气过水声，双侧下肢无水肿，生理性神经反射存在，病理性神经反射未引出。
外院辅助检查：2016年11月30日外院查血常规：白细胞10.15g/L，淋巴细胞8.15g/L，淋巴细胞比率80.31%，升高，肝功能、肾功能、电解质、血糖未见异常，类风湿因子69.49IU/ml升高，肝胆脾彩超：肝右叶囊肿（18X16mm），胆囊多发性息肉（7X6mm），脾大（长240mm，厚73mm，肋下98mm）
2017年1月5日血常规：白细胞11.57g/L，淋巴细胞9.52g/L，淋巴细胞比率82.28%升高，肝功能：球蛋白42.56g/L升高，乳酸脱氢酶296.8U/L，羟丁酸脱氢酶179.36U/L升高，类风湿因子71.50IU/ml升高，血沉100mm/h增快，抗核抗体、抗双链DNA阴性。
初步诊断：脾大原因待查，患者脾肿大、皮疹原因尚不明，注意是否有血液系统疾病如慢性淋巴细胞白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等或风湿免疫疾病，另是否有淀粉样变性、先天性疾病等。
入院后检验结果：
血栓与止血检验结果：PT14.7秒↑，FIB、APTT等未见异常。
自身免疫病相关检验结果：抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、抗角蛋白抗体、风湿全套（ANA、DSDNA、ENA）、抗RA33抗体、抗环瓜氨酸多肽抗体(CCP)均为阴性，类风湿因子及其分型结果见图1。
图1 患者入院时类风湿因子及其分型检验结果
血常规(部分结果)：如图2所示。
图2 患者入院时血常规部分项目检验结果
其它检验项目：
生化肝功能：球蛋白42.56g/L↑，羟丁酸脱氢酶179.36U/L↑，乳酸脱氢酶262U/L↑；血沉59mm/H↑；免疫球蛋白IgM9.54 g/L↑，免疫球蛋白IgG5.0 g/L↓；乙肝表面抗原38.09IU/mL+，乙肝E抗体0.04S/CO+，乙肝核心抗体10.14S/CO+；糖类抗原12547.4U/mL↑；乙肝病毒(HBV-DNA)4.31*102IU/mL↑；尿常规白细胞2++。
类风湿因子、免疫球蛋白IgM定量结果与既往结果存在明显差异，立即使用当天原管血清样本复查IgM9.31g/L↑、RF15200.0IU/mL↑；于2-8℃存放两天IgM4.82g/L↑、RF71.5IU/mL↑，血清管中出现肉眼可见的白色沉淀；37℃孵育4小时检测IgM9.76g/L↑、RF18400.0IU/mL↑并且血清管中凝集现象消失血清清亮，与管床医生联系考虑患者血中存在Ⅰ型冷球蛋白并建议申请血清免疫固定电泳、冷球蛋白项目检测，结果如图3。
图3 患者2-8℃血清标本出现明显白色沉淀（左）；分离后的血清标本2-8℃存放七天，离心前后均可见白色沉淀析出（中）；免疫固定电泳结果(37℃温育解聚处理后)：血中可见IgM-κ型M蛋白（右）。冷球蛋白含量约7860mg/L。
病理检查：患者行右侧腹股沟淋巴结、淋巴结穿刺细胞学检查，结果如图4-1、4-2所示。
图4-1 淋巴结穿刺细胞学检查
图4-2 右侧腹股沟淋巴结穿刺细胞学检查
治疗过程：自患者入院后行CHOP方案(地塞米松15mg、环磷酰胺1200mg、盐酸吡柔比星40mg，硫酸长春地星4mg，)治疗六疗程后加用美罗华600mg巩固两疗程，；
2020.8患者行骨髓穿刺及活检术，骨髓组织学检查：小B淋巴细胞异常增生，考虑患者非霍奇金淋巴瘤复发；再次予以R-COP方案(地塞米松15mg、环磷酰胺1200mg、硫酸长春地星4mg，美罗华600mg)化疗六疗程。治疗过程中注意输注药物温度，避免低温输液引起冷球蛋白沉积。至2021年1月患者随访超4年，血常规淋巴细胞#、淋巴细胞%以及LDH水平变化见图5-1、5-2、5-3
图5-1随访期间外周血淋巴细胞#水平变化
图5-2随访期间外周血淋巴细胞%水平变化
图5-3随访期间血浆LDH水平变化
患者双下肢、臀部皮肤紫癜，在夜间睡眠、受热时缓解的原因是？
患者于2017年2月冬季就诊，冷球蛋白血症在秋、冬、春季由于环境气温变化较大，临床表现明显，其致病机制目前考虑为冷球蛋白遇冷直接阻塞小血管或是形成免疫复合物沉积于血管壁导致系统性血管炎，受热时轻度冷球蛋白血症患者临床表现可自行缓解，按照冷球蛋白克隆类型（组成）、沉淀析出时间可将其分为三型，[1]如图6：
图6 冷球蛋白分型及常见临床表现
Ⅰ型冷球蛋白为单克隆IgG、IgA、IgM或游离轻链，常见含量约在5-20g/L,在32℃数分钟至数小时即可迅速出现沉淀，以雷诺氏综合征、肢端紫绀、坏疽为临床表现，基础疾病主要为B细胞淋巴增殖性疾病如：多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、淋巴瘤及慢性淋巴性白血病等。
Ⅱ型冷球蛋白通常为单克隆与多克隆成分并存，常见含量1-5g/L，在23℃数分钟至数天(<3天)即可出现沉淀，以肾病、神经病变、紫癜为临床表现，多见于丙型肝炎、结缔组织病。Ⅲ型冷球蛋白为多克隆混合免疫球蛋白，含量小于1g/L，在小于23℃数天（3-7天）才可出现沉淀，以白细胞破坏性血管炎、B细胞组织浸润为临床表现，见于感染（病毒、细菌及寄生虫）、自身免疫性疾病等。
该患者血常规淋巴细胞升高、右侧腹股沟淋巴节肿大进行淋巴节穿刺细胞学检查后明确非霍奇金淋巴瘤诊断，继发Ⅰ型冷球蛋白血症。
非霍奇金淋巴瘤继发冷球蛋白血症的治疗方案选择有哪些？
对明确病因的冷球蛋白血症以治疗原发病为主，通过监测冷球蛋白含量改善冷球蛋白血症。根据冷球蛋白分型的检验结果，采取治疗方案如下：Ⅰ型冷球蛋白为克隆性浆细胞，常用细胞毒性药物如：沙利度胺、美罗华、强的松、环磷酰胺等并观察单克隆成分减少情况；血浆置换适用于冷沉淀或血清高粘综合征出现严重的肾功能不全患者；Ⅱ型、Ⅲ型冷球蛋白多见于病毒感染和自身免疫病，常用抗感染、类固醇激素以及血浆置换十分有效[2-3]。
根据冷球蛋白分型情况、患者药物耐受情况以及患者临床表现等及时调整治疗方案。本病理中患者2020年8月骨髓穿刺检查，髓象淋巴细胞占47.5%考虑淋巴瘤复发，给予利妥昔单抗、地塞米松、美罗华、护心护肝及碱化对症治疗，好转后出院。
该患者RF、IgM检测指标存在明显差异的原因？
结合既往检测结果，检验人员从原始样本复查、检测系统、样本性状、抗原过剩等角度出发排查原因时，发现2-8℃样本库存放的血清、血浆均分层，出现白色沉淀，37℃孵育4小时后沉淀完全消失。
考虑冷球蛋白因温度降低而沉淀析出造成RF、IgM检测结果明显降低。对存在冷球蛋白的标本，应使用37℃孵育4h后的标本尽快对可能存在干扰的检验项目（如血总蛋白、免疫球蛋白定量、类风湿因子等）进行复查，从而保证检验结果真实、可靠。同时，冷球蛋白阳性结果应立即与临床进行沟通，注意输液温度、患者御寒保暖等。
冷球蛋白实验室检测的检验前质量如何保证？
“样本采集后应立即送检，否则会影响检验结果”这是所有实验室对样本转运的要求，但对于存在冷球蛋白的血标本，即便做到了及时采集、立即送检也会对检测结果产生影响，因此，在血标本采集前对采集用品的孵育、采集后立即使用温控设备保存、转运较为合适，转运过程须保证生物安全。
对存在冷球蛋白的血清标本，免疫固定琼脂糖凝胶电泳如何进行复查？
首次免疫固定分型结果 → 解聚处理后 → 37℃温育解聚处理
血清免疫固定电泳常用5%β巯基乙醇解聚复查，可将多聚体免疫球蛋白拆为单体，有助于M蛋白的分型判断。单克隆型冷球蛋白常见IgM型、IgG型，少见IgA型，IgG型无多聚体，因此对可能形成聚合体的冷球蛋白类型在血清免疫固定电泳检测首选将样本、解聚液37℃共同温育4h解聚后立即检测，提高M蛋白分型检测准确性同时改善样本分析TAT。
冷球蛋白检测相关知识点有哪些？
样本采集：采血耗材如针头、注射器、采血管在37℃预热1h后建议采血15-20ml。
样本分离：采血后的试管立即置于37℃温箱1h，自然凝固后将试管于温控离心机中37℃、2500r/min离心10min分离血清。
样本检测及结果判断：37℃可设计自身对照阴性管；检测管放置于4℃冰箱连续观察七天，若无沉淀则报告阴性；若出现沉淀于37℃静置4-5h观察沉淀是否重新溶解，如沉淀重新溶解，则报告阳性[4]。通过冷盐水进行等体积置换血清洗涤沉淀，温育后对洗涤效果进行评价并检测冷球蛋白含量。对临床高度怀疑冷球蛋白存在的阴性结果可建议至少进行三次复查。
既往检测结果存在差异与临床沟通的重要性
在日常工作中，通过回顾近期实验室LIS系统既往检测结果，对一些比较稳定的检测项目如：总蛋白（TP）、免疫球蛋白（IgG、A、M）以及乙肝五项等，若发现两次检测结果间差异较大，可从检测系统、样本性状、检测干扰因素等方面进行排查，及时与临床医生进行主动沟通，避免采取不必要或者错误的临床决策。
该患者冷球蛋白血症引起臀部紫癜，乙肝病毒感染引起脾肿大，经COPD化疗后明显好转，患者肾功能良好无需进行透析治疗。同理，当发现本次检验结果与既往检验结果存在明显差异时，及时辅助临床寻找原因、更好的理解检验报告，需要检验科主动加强与临床的沟通工作。
值得注意的是，目前国内开展冷球蛋白检测的实验室并不多，由于冷球蛋白检测条件的特殊性，必须在检验前就要予以足够的重视。当遇到冷环境下以弥漫性血管炎为主要临床表现且受热缓解或部分缓解时，冷蛋白（冷球蛋白、冷纤维蛋白原、冷凝集素等）相关检测对临床诊疗至关重要。
冷球蛋白血症可见于恶性浆细胞增殖性疾病、HCV感染以及自身免疫病等，可引起弥漫性血管炎、肾功能不全以及周围神经病变，通过早发现、早诊断、早治疗，可有效改善本病预后。无症状冷球蛋白血症患者不必治疗，定期随访即可。但由于国内开展该项目检测的实验室并不多，冷球蛋白血症的诊断已成为临床较为棘手的问题。
冷球蛋白检测注意事项较多，包含检验前：血标本采集准备、采血量和采集后运送、血清分离；检验中：观察时间、检测温度控制、检测结果判断等步骤。冷球蛋白定性、定量检测标准化检测对临床诊断冷球蛋白血症进而查找病因就显得尤为重要。检验科加强与临床之间的沟通，是临床更好的理解检验报告、检验人员业务水平提高的“桥梁”。
点评专家:李春蕊,华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科教授 主任医师
参考文献
[1]Ravishankar Sargur,Peter White,William Egner.Cryoglobulin evaluation: best practice?Ann Clin Biochem 2010;47:8-16.
[2]ZakK. Shihabi.Cryoglobulins:An Important but Neglected Clinical Test[J].Annalsof Clinical & Laboratory Science,2006;36(4)：395-408
[3]《NCCN肿瘤学临床实践指南》非霍奇金淋巴瘤2015年第2版
[4]]芮宏亮,程虹,谌贻璞.不同检测条件影响冷球蛋白检测结果的实验研究[J].中华检验医学杂志，2016,39(12):901-905
END
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。
编辑：徐少卿 审校：陈雪礼