干货笔记： NSCLC中RET融合
2017/11/30
激酶基因融合是实体瘤和血液恶性肿瘤中重要的癌基因。第一成功案例为伊马替尼治疗BCR-ABL融合阳性的慢性淋巴细胞白血病，后来克唑替尼有效延长了ALK-ROS1基因融合的晚期NSCLC的生存期。在NSCLC中，主要的染色体重排涉及ALK（3-7％），ROS1（1-2％），NTRK(3.3％)和RET(0.7-2％)基因，虽然它们占肺癌患者的一小部分，但考虑到全球每年约180万新的肺癌病例，治疗这些罕见的染色体融合是深远的。RET融合多见于不吸烟肺腺癌，对化疗相对敏感的晚期NSCLC患者。RET融合的检测方法主要为FISH和PCR，不同于ALK和ROS1融合的检测方法。目前RET 抑制剂ORR 16%- 47%，无进展生存PFS是2-7个月。今天的文章主要介绍NSCLC中RET融合基因，描述RET致癌激活的机制，RET融合的诊断方法，不同RET融合变异体的作用，RET融合与临床和病理特征之间的关系，以及多靶点的RET抑制剂在NSCLC中的TKIs以及针对RET定向抑制的潜在逃逸机制。
RET基因分子生物学与融合基因
RET（Rearranged During Transfection）原癌基因最初是在1985年通过NIH3T3细胞与人类淋巴瘤DNA的转染所证实。RET定位于10号染色体（10q11.2），有21个外显子染色体，可编码受体酪氨酸激酶，该激酶包含三个结构域，胞外结构域（含有四个钙粘蛋白 钙结合位点和富含半胱氨酸的区域），跨膜结构域和细胞内激酶结构域，与ALK激酶结构域具有37％的氨基酸序列同源性。RET配体主要是神经营养因子 （GDNF）家族，包括GDNF，artemin，neurturin和persephin。配体结合后，RET激酶结构域变为同二聚体，自磷酸化激活RET，激活细胞增殖，迁移和分化有关的下游途径（RAS / MAPK / ERK，PI3K / AKT，JAK / STAT）。
经过一系列的研究，在NSCLC中，至今已经鉴定了至少12个融合RET配偶体基因（KIF5B-RET11-13，CCDC6-RET，NCOA4-RET，MYO5C-RET，EPHA5-RET，TRIM33-RET，CLIP1-RET，ERC1- RET，PICALM-RET，FRMD4A-RET，RUFY2-RET，TRIM24-RET RET）。其中KIF5B-RET融合最为常见，如下图所示。
对于所有RET融合变体，染色体融合导致伴侣基因的卷曲螺旋结构域和RET细胞内激酶结构域之间的混合，尽管有断点，其功能保持不变。 RET伴侣基因的卷曲螺旋结构域诱导RET不依赖配体的同源二聚化并通过自动磷酸化激活RET酪氨酸激酶结构域。RET融合蛋白的激活机制类似于NSCLC中融合的ALK的致癌激活，但与ROS1明显不同。 在EML4-ALK融合基因中，EML4中的卷曲螺旋结构域与ALK激酶结构域融合，赋予寡聚化和组成型激酶活化，而卷曲螺旋结构域在NSCLC中的ROS1融合基因中并不一致地存在，并且它们不必驱动肿瘤发生。
分子诊断方法
虽然IHC是检测ALK和ROS1阳性NSCLC的有效检查工具，但其在RET检测中，由于频繁的假阳性（FP）或假阴性（FN）结果而令人失望。FISH原位荧光杂交，是高度灵敏的技术，并且代表了检测RET融合的金标准。 然而，它仍然相对昂贵，需要专门的技术人员，此外，对于特定的RET融合伴侣基因，FISH可能检测不到，也没有任何定义RET阳性的标准cutoff值。RT-PCR已被纳入RET筛选研究的大部分，该技术的主要优点在于可能识别特定的已知RET融合伴侣。 此外，RT-PCR被成功应用于鉴定细胞标本中的RET融合。其主要限制是无法用预先选择的引物检测新的或未知的易位伴侣，可能低估了NSCLC中RET融合的真实发病率，同时从福尔马林固定的石蜡包埋的样品中获得的RNA因质量不好，也会影响结果。 因此，在大多数RET融合的筛选研究中，RT-PCR通常与其他检测方式（主要是FISH或IHC）结合使用。总之，IHC由于低灵敏度（55％-65％）和可变特异性（40％-85％），不足以检测RET融合，FISH高度敏感（100％），但特异性不理想（45％ 60％），RT-PCR可以识别特定的已知RET融合伴侣，但是受到RNA质量的影响，不能检测到新的RET融合，从而低估了患病率。目前常用的检测方法是
RET的临床意义
最初以为在非吸烟者腺癌患者中， RET融合更常见。与ALK融合和EGFR突变的患者相比，RET阳性NSCLC患者肿瘤分化更差。在研究中，11例（64％）RET阳性非小细胞肺癌患者中有7例为实性，4例为印戒细胞癌，印戒细胞。RET融合和其他驱动基因亚型在性别、年龄和吸烟史上没有区别，但RET融合NSCL更年轻（73% < 60 岁）、非吸烟比例更高（82%）。此外，与其他腺癌相比， RET融合基因患者原发病灶较小（<3 cm），N2病变更多（54％vs 23％）。165例RET阳性NSCLC患者的大型回顾性分析中发现了RET融合与转移性疾病之间的显着相关性。
最初RET融合基因被认为与其他分子改变相互排斥。然而，一项回顾性研究显示12例RET融合非小细胞肺癌患者中有4例（33％）伴有其他基因改变（EGFR，MAP2K1，CTNNB1，AKT1。在另一项研究中发现在22例RET阳性NSCLC患者中有10例（45％）伴有其他突变，其中8例携带TP53突变，一例携有MET扩增和CTNNB1突变，另一例携有EGFR基因的外显子21罕见突变。在最近的另一项回顾性分析中，28例RET融合切除腺癌中有6例（21％）伴有EGFR突变。最后，还报道了一些在使用EGFR-TKI后进展的EGFR突变的NSCLC患者中发现了CCDC6-RET和NCOA4-RET 融合。表明EGFR突变和RET融合基因可能共存，RET融合可能是原发性或获得性EGFR抑制性耐药的机制。
RET抑制剂在NSCLC中的临床应用
RET融合最先是在甲状腺癌上发现，多靶点TKI如舒尼替尼、索拉非尼、卡博替尼、乐伐替尼、阿帕替尼在RET融合细胞系上进行了基础研究，但这些药物相关的随机或回顾性临床研究还是很少。RET融合与胸苷酸合成酶mRNA水平升高显着相关，以培美曲塞为基础的化疗方案的ORR是 40％，无进展生存期PFS是19个月。然而， RET融合的NSCLC患者是因为RET本身就是很好的预后因素还是因为RET融合提高患者对化疗敏感，目前还不明确。大多数回顾性研究显示，肺癌中RET融合与肺癌的总生存（OS）或无复发生存率无显著相关性。另一方面，有关RET阳性患者化疗敏感性的数据是相互矛盾的。至今还没有批准的RET选择性抑制剂，但在临床前模型和临床试验中，已经评估了几种具有抗RET活性的多靶点药物。 下图就是评价中位抑制浓度（IC 50）的效力，以及具体说明这些抑制剂中的靶标。
凡德他尼
靶点是VEGFR 2-3, EGFR 和RET，IC50是100nM。在四项随机III期试验评估了vandetanib联合多西他赛(ZODIAC）和培美曲塞（ZEAL）或单药（ZEST和ZEPHYR）在NSCLC治疗中的作用。在未经筛选的人群中，无论是联合组还是标准化疗组都没有显著的OS获益。ORR范围从3％到20％。对这四项试验进行回顾性分析，在937例患者中FISH检测到7例（0.7％）RET融合的患者，其中有3例患者接受vandetanib治疗，无一例缓解。在日本进行的一项多中心的2期临床试验（LURET），筛选了1536例EGFR突变阴性的非小细胞肺癌患者，纳入符合条件的17例RET融合的患者，31％为CCDC6-RET阳性，53％为KIF5B-RET融合，16％未知的RET状态。患者每天连续口服凡德他尼300 mg（每天一次）。客观缓解率ORR为53%，中位无进展生存期为4.7个月， OS是11.1个月。在CCDC6-RET亚型中ORR 83%而PFS 8.3个月；在KIF5B-RET亚型，ORR 20%而PFS 2.9个月。最常见的3或4级不良事件（AEs）包括高血压（58％），皮疹（16％），腹泻（11％）和延长QT校正间期（11％）。 停药率为21％，超过50％的患者需要减量。韩国II期临床试验纳入18例RET融合的NSCLC患者，KIF5B-RET占28%，CCDC6-RET占11%，RET状态未知占56%，。患者每天连续口服凡德他尼300 mg（每天一次）。ORR 15%、DCR 65%，PFS 4.5个月，OS 11.6个月。3~4级AEs高血压17%、QT间期延长11%，减量占22%，5例KIF5B-RET无一例客观缓解。
卡博替尼
靶点是VEGFR-2、MET、 AXL、 c-KIT和 RET（IC50 值 5~20 nM）。在II期临床试验中，使用FISH或NGS筛查26例RET融合NSCLC患者，评估卡唑替尼（60 mg / d）。其中62％有KIF5B-RET融合，15％的患者融合较少（CCDC6-RET，CLIP1-RET，TRIM33-RET，ERC1-RET），23％有未知的融合配偶基因。显示ORR为28％，中位PFS和OS分别为5.5个月和9.9个月。 KIF5B-RET融合非小细胞肺癌患者的ORR分别为20％和50％。 3级和4级治疗相关AE升高脂肪酶（15％），肝转氨酶升高（8％）和高血压（4％）。分别有8％和73％的患者出现药物停用和剂量减少。在这项试验中，19名患者的NGS未显示涉及已知的卡博替尼靶标（MET，AXL等）的同时激活性改变，突出显示了cabozantinib的治疗效果可能是由于RET靶点。
乐伐替尼
靶点是VEGFR 1-3, FGFR 1-4,PDGFRα, c-KIT 和RET， Lenvatinib在RET多激酶抑制剂中最低的IC50（1.5nM）。在II期临床试验中，对25例RET融合的NSCLC患者评估乐伐替尼的疗效，其中 28％的患者既往接受过抗RET治疗。基因检测发现患者中52％是KIF5B-RET融合，48％是其他已知RET融合基因。ORR 16%，DCR 76％和中位PFS是 7.3个月。接受过RET治疗的7名患者，使用Lenvatinib的ORR与未经RET-TKI治疗的使用Lenvatinib患者的ORR一样都是14％。 KIF5B-RET和其他融合类型ORR类似，但PFS时间较短3.6个月对比9.1个月。乐伐替尼相关3~4级AEs为92%（高血压58%，蛋白尿16%），减量和治疗中断发生率分别为64%和76%。
其他RET抑制剂
大多数关于舒尼替尼，索拉非尼，艾乐替尼、ponatinib、dovitinib、阿帕替尼治疗RET融合肺癌中的活性的证据来自临床前研究，病例报告和患者回顾系列。 舒尼替尼和索拉非尼具有相似的靶点谱，与其他多激酶抑制剂相比，它们在抑制RET方面似乎不太有效。
舒尼替尼靶向VEGFR 1-3，PDGFRβ，c-KIT，FLT-3和RET，但IC50高（200-1300 nM81），索拉非尼抑制VEGFR 1-3，PDGFRβ，c-KIT，FLT-3，RET，BRAF和c-RAF，（IC50，15-150nM），抑制RET的作用有限。舒尼替尼针对非吸烟者腺癌肿瘤的II期临床试验正在进行，这些肿瘤不包含EGFR，KRAS或ALK分子改变。
Alectinib靶点是ALK, LTK, CHEK2, FLT3, RET (IC50 4.8 nM).，不作用于VEGFR -2，可避免抗血管成长药物毒性。值得注意的是艾乐替尼对两种常见的RET融合突变有效（V804L和 V804M）。在日本和美国艾乐替尼治疗RET融合Ⅰ/Ⅱ期研究正在进行。
Ponatinib靶点是BCR-ABL, FLT-3, SRC, c-KIT, FGFR, VEGFR, PDGFR和 RET，IC50是25.8nM,一些临床前数据支持Ponatinib在带有RET-突变体（V840L，V840M，G810A）融合变体的RET-TKI抗性癌细胞模型中的潜在作用 。目前，ponatinib治疗RET融合NSCLC的Ⅱ期研究正在进行。
Dovitinib靶点是PDGFRβ, c-KIT, FGFRs, VEGFRs, FLT3, RET，IC50：20nM, dovitinib在含有不同分子改变（包括RET融合癌基因）的非小细胞肺癌中的试验已经完成，预计结果即将出台。
阿帕替尼靶点是VEGFR-2, PDGFRβ, SRC, c-KIT和RET，IC50是13 nM。阿帕替尼治疗RET融合的NSCLC患者的Ⅱ期研究正在进行。此外，还有一些RET抑制剂AD80，luminespib治疗RET融合的临床试验还在进展中。
RET抑制剂未来研究方向
目前多靶向激酶抑制剂治疗RET融合NSCLC的ORR16%-47%，PFS2.3~7.3个月，在有效率和生存数据上差于其他NSCLC驱动基因。EGFR-TKI ORR: 56%-85%, 中位 PFS: 9.2-13.7个月。ALK-TKI，ORR: 60%-95%,中位PFS: 8-11 months，ROS1-TKI ORR: 65%-85%, 中位 PFS: 9.1-19.3个月。此外，RET TKIs 引起的3~4级毒性发生率高，主要因为RET-TKI对VEGFR激酶的抑制作用，导致高达70%患者减量。因此需要选择作用更强，毒性更小的RET抑制剂。在RET抑制剂中，期待值高的是艾乐替尼和ponatinib。 两种药物都对RET突变V840M / L和G810A有活性，并且alectinib特别有前景，因为它不靶向VEGFR-2，避免了与抗血管生成有关的特定毒性。 对于alectinib，抗VEGFR-2效应的不存在不仅可以降低毒性，还可以避免剂量减少。 然而，迄今为止，还没有足够的关于RET融合NSCLC中alectinib和ponatinib活性的临床证据，迫切需要进一步的临床研究。在3000多例非小细胞肺癌患者的单独队列中，20％RET重排肿瘤中NGS检测到MDM2扩增。在回顾性研究中，20-45％的RET重排的NSCLC患者中已经描述了伴随的分子改变，包括EGFR，MAP2K1，CTNNB1，AKT1，MET和TP53。虽然RET融合的肺腺癌表达PD-L1，免疫治疗对RET重排的NSCLC患者潜在的未来影响是有吸引力的。 然而，由于缺乏在RET重排的NSCLC患者中测试抗PD-1 / PD-L1疗法的研究，在这种疾病背景中免疫疗法的益处仍然是一个悬而未决的问题。值得注意的是， RET抑制剂在治疗肺癌患者中报道的低PFS以及RET重排的NSCLC组织中不同分子改变的共存，强调了针对RET融合的NSCLC患者的组合治疗策略。下图说明了RET抑制的不同逃避机制和一些克服抗性的潜在治疗策略。
新模板还没好，设计尸在正在补脑...
参考文献：
Clinical and translational implications of RET rearrangements in nonsmall cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2017 Nov 8.