注意！这些基因的变异影响免疫疗效！
走过路过不要错过
在免疫盛嚣于世的当今，有一句话是我们经常提醒患者朋友们的：“免疫治疗并非神药，要事先了解自己的病情是否适合PD1/PDL1免疫治疗，疗效几何，然后再行用药”。也就是临床常常提到的生物标志物的问题。每一种治疗都有自己合适的患者人群，也因此我们会着重于各种治疗的预测筛选指标biomarker的研究。患者通过检测指标为自身的治疗疗效进行预估，可有效避免盲目用药带来的病情延误。
回到免疫治疗的biomarker上，PDL1是我们比较认可的首选标志物。患者朋友将近期的肿瘤组织送到病理科进行免疫组化检测，获得自己组织中PDL1的蛋白表达百分比，百分比越高，疗效越好。但是结合实际，PDL1检测还是有很多阻力：1.相对非绝对指标，也就是PDL1阴性的患者也不一定没有疗效，同时考虑到检测的组织很难代表全身所有的肿瘤组织；2.当下的组织，有的人会拿几年前的蜡块进行检测，检测价值就会下降很多，因为任何的治疗都会导致体内免疫环境的改变，PDL1表达也是变化的，过去的无法代替当下，而患者是非常拒绝再行有创取材的。
而与此同时，通过基因检测来推测免疫疗效的研究也获得了多种研究进展。今天小编就汇总一下，在基因检测中那些与免疫治疗息息相关的基因指标。
肿瘤突变负荷TMB
TMB（tumor mutational burden）即肿瘤突变负荷，指的是一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失（非同义突变）突变的总数。简单理解为肿瘤细胞突变的数量。体细胞突变一旦发生，可表现在RNA和蛋白水平，产生的新抗原（或新表位）、蛋白片段、肽段等被自身免疫系统识别为非自我（non-self）抗原，激活T细胞，而引起免疫反应。因此TMB越高，免疫治疗疗效越好。这一点可以解释很多问题，也得到了很多的试验印证。
第一，为什么肺癌、黑色素瘤之类的患者相比胃癌、食管癌的患者更适合免疫治疗?答案是肺癌黑色素瘤的TMB在整体癌种中是比较高的。
第二，多种试验研究显示TMB的高低可以很好的将适合免疫治疗的患者筛选出来。
Checkmate026研究：nivolumab单药治疗初治晚期非小细胞肺癌患者，高TMB的患者显疗效。
2017年世界肺癌大会上，报道了CheckMate-032的临床试验结果。这是一项纳入了401名一线治疗失败的晚期肺癌患者的II期临床试验，接受PD-1抑制剂单独或联合伊匹木单抗治疗。按照TMB高低划分成TMB高、TMB中、TMB低三类病人。
接受nivo+ipi联合治疗的TMB高低中三组有效率分别为：46%、22%、16%，TMB高的人群有效率比其他两组高2倍以上！
接受nivo单药治疗的TMB高低中三组有效率分别为：21%、7%、5%， TMB高的人群有效率比替他两组的ORR高3倍！
TMB在免疫上的价值是值得肯定的，而全外显子的检测在普通临床是不现实的，技术经济都是重负。国外研究者就采用了至少覆盖1G外显子的大型panel来代替全外显子的检测，结果显示，采用覆盖几百甚至几千基因的大PANEL也可以对免疫疗效成功起到分层预测作用。这一点在国内多家二代基因检测公司被应用。我司目前也正在开展覆盖1000多个基因的大型检测PANEL，可以评估肿瘤患者的TMB值。
微卫星稳定MSI
去年，K药获批了一个适应症，不是针对某个癌种，还是针对基因检测具有MSI-H的实体瘤患者二线之后都推荐使用免疫治疗。
高度微卫星不稳定（MSI-H）是DNA错配修复功能缺失后造成的一种DNA的高频突变。这类患者TMB非常高，因此免疫疗效也特别好。且该类基因变异在很多癌种中都有出现，所有癌种都可以检测，尤其是子宫内膜癌和消化道的癌种。
这类患者二线之后接受免疫治疗的有效率都在30%以上，有的试验可达60%多。
PBRM1
著名的《科学》杂志曾经发表了一篇重磅的研究论文。科学家们找来了35个接受PD-1抑制剂治疗的肾癌患者的标本，进行了详细的分析：PD-L1表达、肿瘤突变负荷TMB、肿瘤大小、治疗的经过等可能的影响因素，发现在治疗有效组和无效组，没什么区别。然后，他们又对这些患者的肿瘤组织进行了深度的外显子组测序，发现治疗有效组和无效组，PBRM1基因突变的比例，差别很大——治疗有效组82%的患者携带PBRM1基因突变，而无效组只有23%。接着，科学家又找了另外一个63人的队列，一模一样又做了一遍，结论如出一辙的：治疗有效组63%的患者携带PBRM1基因突变，而无效组只有21%的患者携带该突变。
除了上面介绍的免疫疗效预测指标之外，下面介绍影响免疫治疗疗效的相关指标。主要分为3方面，与免疫治疗疗效正相关的基因：MMR，POLE/POLD1；与免疫治疗疗效负相关的基因：PTEN,JAK1/2,B2M,EGFR/ALK,STK11；引起免疫治疗超进展的基因：MDM2/4,DNMT3A。
MMR
即Mismatch Repair,错配修复，它是重要的DNA修复系统。根据错配修复功能的不同，分为错配修复缺陷（Mismatch Repair Deficiency,dMMR）和错配修复完整（Proficient Mismatch Repair,pMMR）。
目前，最常用的筛查结直肠癌MMR表达有无缺失的方法有两种：一是利用免疫组化检测MMR相关蛋白（MLH1, MSH2, MSH6和PMS2）的表达，若结果显示任一蛋白完全缺失，则判读为dMMR；若显示无蛋白缺失，则判断为pMMR。
二是用PCR检测多个微卫星位点以判断有否存在MSI。≥40%，MSI-H <40%，MSI-L/MS-S。
而NGS在这方面具有明显优势，通过NGS检测结合生信流程分析，可以同时检测MMR基因突变和MSI状态，一次检测可以获取到更多信息。
目前FDA批准K药用于治疗不可切除或转移的微卫星不稳定性高（MSI-H）或错配修复缺失（dMMR）的成人和儿童实体肿瘤，或者在用氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后进展的MSI-H或dMMR转移性结直肠癌（mCRC）。Nivolumab用于治疗MSI-H或dMMR的mCRC患者（在氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗后）。
dMMR 引起的微卫星不稳定诱发更多的基因突变，从而产生新生抗原；这些新生抗原由于结构异常而更容易被机体自身免疫系统识别，启动抗肿瘤免疫；而肿瘤微环境中的免疫抑制因子激活了 T 细胞的 PD-1/PD-L1 通路，使 T 细胞活性受到抑制；阻断 PD-1/PD-L1 通路可以解除免疫抑制状态，使免疫系统得以全面对肿瘤细胞展开攻击，最终实现对肿瘤细胞的清除。
POLE
Pole基因参与DNA修复和合成，减少基因突变的产生，与免疫治疗反应呈正相关，特别是针对POLE基因突变的子宫内膜癌/肠癌/肺癌患者使用PD-1单抗后效果显著。据报道，一名POLE基因突变的子宫内膜癌患者，用药8周后，肿瘤明显缩小，而且疗效维持了至少14个月。
POLD1
POLD1 基因编码了 DNA 聚合酶 δ 的 125-kDa 的催化亚基，在 DNA 复制和修复中扮演了至关重要的作用,POLD1 的变异也会导致更多基因突变。目前结直肠癌中 POLD1 基因体细胞致病变异报道较少，但在MSI亚型的结直肠癌中存在POLD1体细胞突变。
2015年的Science（IF:37.205）的文章曾报道对K药响应的NSCLC患者中发现POLE以及POLD1基因的突变，而且POLE以及POLD1基因的突变与TMB-H有关。
PTEN
PTEN是一种抑癌基因，PTEN 缺失可能导致PD-1抑制剂有效率低。这个结论在一项接受Pembrolizumab或Nivolumab治疗的黑色素瘤队列研究中得到了证实。 黑色素瘤患者中，PTEN缺失与TIL减少正相关，PTEN高表达会对抗PD-L1免疫治疗表现出好的疗效。
2016年，科学家们通过研究39名使用PD-1抗体治疗的恶黑患者发布了一个研究成果：PTEN缺失的患者使用PD-1抗体的有效率可能比较低 (Peng et al., 2016)。具体数据如下图，简单解释一些这个图：左上是肿瘤进展的患者，红色的柱子代表十位PTEN缺失的肿瘤患者，PD-1抗体治疗之后，6位患者肿瘤明显增大；蓝色的柱子代表PTEN表达正常的29位患者，PD-1抗体治疗之后只有4位患者肿瘤明显增大。
具体机制： PTEN缺失，会导致PI3K通路增强，会增加肿瘤免疫抑制因子的表达，导致肿瘤浸润T细胞减少，抑制自我吞噬，从而导致T细胞介导的细胞死亡。但另有研究报道，PTEN 突变（PTEN T131N）的患者PD-1抑制剂更有效。
JAK1/2
JAK激酶（Janus kinase），是一个细胞内非受体酪氨酸激酶家族，其抑制剂主要是竞争激酶结构域与ADP的结合而发挥作用（图1右），进一步通过调控下游STAT信号通路发挥作用。JAK1/2属于JAK激酶家族成员。之前的研究报道23例黑色素瘤患者中，患者#15具有Janus激酶1 JAK1（P429S）杂合突变；其余22例患者没有检出与干扰素受体通路中相关基因的纯合型功能失活突变。
从上图看出对治疗有响应患者的CD8细胞和PD-L1含量较高。患者#15的CD8细胞和PD-L1含量较低。
具体机制： JAK1/2突变以后，免疫系统就很难识别肿瘤了，免疫系统就“瞎”了，不认为体内有肿瘤。肿瘤细胞中JAK1/2基因突变导致PD-L1表达缺失及对γ干扰素无响应，所以具有该突变的肿瘤患者可能对PD-1阻断治疗没有反应。
B2M
β-2-微球蛋白（beta-2-microglobulin，B2M），β2M突变导致HLA缺失：肿瘤细胞表面的HLA-1表达缺失，无法实现抗原呈递，CD8+T细胞失去识别功能。
HLA和B2M都是I型MHC分子复合物的编码基因，β2MG突变导致HLA的缺失，HLA的多样性减少，导致部分新抗原不能呈递到细胞表面，引起毒性T细胞反应，从而形成原发性耐药或免疫药物无响应的情况。这项研究表明，HLA的表型对免疫药物疗效影响甚大，总的来说，HLA的多样性越多，能呈递新抗原的种类就越多，免疫药物的疗效就越好。
EGFR/ALK
FDA对K药的批文中明确提出了“针对EGFR和ALK靶点没有突变”的NSCLC患者。一篇回顾性研究发现，EGFR/ALK突变患者 vs 野生型患者的ORR分别为 3.6% vs 23.3%， mPFS为2.07个月 VS 2.58个月（HR=0.515），药效非但不明显，反而比EGFR/ALK野生型的肺癌患者更低！
STK11
(serine/threonine kinase 11,STK11)基因，编码的蛋白是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 在染色体重组、细胞代谢、细胞凋亡和细胞增殖中具有重要作用。2017ESMO大会上，公布了一项研究，分析基因突变与免疫治疗疗效之间关系。对1619例NSCLC患者的组织样本进行了全基因组测序及PD-L1的检测，并计算了这些样本的TMB，结果表明，PD-L1表达与TMB并无显著相关性。此外，200多名患者被发现存在STK11失活突变，且多为肺腺癌患者，这些患者的肿瘤组织中免疫细胞浸润较少（图1A, 彩色直线代表多种免疫细胞相关基因的表达），免疫治疗疗效也较差（图1B，P=0.0314），这些结果表明，STK11的失活突变可能与免疫治疗疗效负相关。
STK11突变的患者，经常伴有KRAS突变， KRAS和STK11/LKB1都突变的患者，使用PD-1抗体的有效率只有9.1%。KRAS突变，STK11/LKB1和TP53都不突变的患者，有效率21.3%。
B2M
超进展（HPD）是指肿瘤异常的加速生长，同时满足以下3个条件：1.在接受免疫检查点抑制剂治疗后第一次评价时进展，或至治疗失败时间（TTF）<2月；2.肿瘤体积增加>50%；3.肿瘤增长速度（TGR）增加>2倍。HPD并非免疫治疗特有的现象，其实化疗、靶向治疗都会发生，不过因为发生率低。
MDM2/4是p53的关键负调控因子，之前的研究数据中，均有报道过MDM2、MDM4扩增的患者使用免疫治疗可能会发生超进展。2017年的一项研究分析了155名肿瘤患者基因突变与免疫治疗爆发式进展之间的关系，结果发现，携带MDM2/4扩增的4位患者发生爆发进展。
该患者为肺腺癌，基因检测显示MDM2扩增，伴随KIF5B-RET融合，使用白蛋白紫杉醇无效后改用PD-1抗体Keytruda，用药9天之后，患者的状态急剧恶化，严重的乏力，CT检查发现一个月之后患者的肿瘤增大了很多（原文的描述是：9天时间增大1.3倍）。影像数据如下：
DNMT3A
DNMT3A基因，是DNA甲基转移酶，来自UCSD穆尔斯癌症中心的科学家们发现，除了MDM2/MDM4基因扩增的患者在使用PD-1/PD –L1抑制剂后容易发生爆发性的进展之外， 5例发生甲基转移酶DNMT3A基因突变的肿瘤患者中有4例患者也是在短时间内肿瘤同样发生了显著性进展。
HLA
HLA，通常称之为MHC分子或主要组织相容性复合物,除同卵双生子以外几乎找不到HLA相同者，每个人的HLA千差万别，因此，HLA有人体生物学“身份证”之称。它是不同个体免疫细胞相互识别的标志，机体“区分敌我、识别自身、排除异已”的主要遗传标记，参与免疫应答反应，具有非常重要的生物学功能。
HLA-I类（MHC I）和II类（MHC II）基因是编码结合和呈递抗原的分子，使细胞毒性T淋巴细胞经抗原结合槽与成熟的HLA细胞表面蛋白结合，I类基因主要将抗原呈递给CD8+ T细胞，II类基因主要将抗原呈递给CD4+ T细胞。与免疫治疗息息相关。
MSKCC研究人员就针对HLA-1的免疫预测进行了一项研究，对1535名接受免疫检查点抑制剂治疗的晚期癌症患者HLA-I 基因型进行了检测。研究结果显示，与纯合子的患者相比，在HLA-I 位点（A/B/C）高度杂合可提高免疫治疗后的总体生存率。
且不同的亚型也有高低疗效之差。在两组独立的黑素瘤患者中，HLA-B44超型等位基因的患者延长了总生存期（HLA-B44超型的等位基因很可能本身具有强的抗原呈递能力，从而更容易在免疫治疗中获益），而HLA-B62超型等位基因（包含HLA-B*15:01）或HLA-I的体细胞杂合性缺失（somatic LOH）患者预后差。
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参考文献：
1.Peng, W., Chen, J.Q., Liu, C., Malu, S., Creasy, C., Tetzlaff, M.T., Xu, C., McKenzie, J.A., Zhang, C., Liang, X., et al. (2016). Loss of PTEN Promotes Resistance to T Cell-Mediated Immunotherapy. Cancer Discov 6, 202-216.
2.Primary Resistance to PD-1 Blockade Mediated by JAK1/2 Mutations
3. Gainor J F, Shaw A T, Sequist L V, et al. EGFR Mutations and ALK Rearrangements Are Associated with Low Response Rates to PD-1 Pathway Blockade in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC): A Retrospective Analysis[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2016, 22(18):4585.
4. George S, Miao D, Demetri G D, et al. Loss of PTEN Is Associated with Resistance to Anti-PD-1 Checkpoint Blockade Therapy in Metastatic Uterine Leiomyosarcoma.[J]. Immunity, 2017, 46(2):197-204.
Kato S, Goodman A M, Walavalkar V, et al. Hyper-progressors after Immunotherapy: Analysis of Genomic Alterations Associated with Accelerated Growth Rate.[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2017, 23(15):4242
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