HBV RNA的m⁶A修饰通过抑制RIG-I通路逃避宿主固有免疫
摘要
HBV RNA上存在m⁶A修饰位点，作者团队的前期研究认为3.5kb HBV RNA上5’端的m⁶A修饰促进了其逆转录过程，而所有HBV RNA共有的3’端m⁶A修饰则降低了RNA的稳定性。该文发现HBV转录本的m⁶A修饰可以调节宿主对HBV感染后的固有免疫反应。研究发现，m⁶A的甲基转移酶METTL3和METTL14低表达可致维甲酸诱导基因I (RIG-I)对病毒RNA的识别增加，从而刺激I型干扰素的产生。反过来，过表达METTL3和METTL14时则结果相反。病毒RNA的m⁶A修饰抑制了RIG-I信号通路，而病毒RNA的m⁶A位点突变后RIG-I信号通路被激活。m⁶A阅读蛋白(YTHDF2和YTHDF3)可以通过与m⁶A修饰的RNA结合抑制RIG-I对病毒RNA的识别，从而抑制RIG-I信号通路的激活。该研究为带有m⁶A修饰病毒RNA的免疫逃避机制提供了新的思路。
当病毒感染宿主细胞后，代表第一道防线的固有免疫反应会即刻被触发。而病毒可通过抑制宿主的固有免疫反应来逃避宿主的免疫清除，以建立慢性感染。据文献报道，在HBV感染过程中，HBV的前基因组RNA（pgRNA）可被宿主的模式识别受体RIG-I识别，激活免疫应答。然而，近期有研究发现，HBx蛋白可促进线粒体相关MAVS蛋白的泛素化降解从而破坏RIG-I/MAVS信号。因此，HBV与宿主固有免疫系统的相互作用复杂，病毒抑制宿主固有免疫的机制仍需进一步研究。
研究显示，超过25%的哺乳动物转录本带有m⁶A修饰，m⁶A甲基化是mRNA非常常见的修饰，并与包括固有免疫反应、干细胞分化、减数分裂过程、应激反应和癌症等多种生物过程有关。mRNA的m⁶A修饰由METTL3、METTL14和WTAP组成的甲基转移酶复合物添加而成，这种修饰通常富集在细胞mRNA的3’-UTR和终止密码子附近。m⁶A修饰的mRNA被YTH（YT521-B同源域）家族蛋白(YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3)识别，以调控mRNA的稳定性、翻译和定位。m⁶A去甲基酶FTO和ALKBH5能够消除m⁶A甲基化,表明m⁶A修饰受甲基转移酶和去甲基酶的共同调节。超HBV基因组全长的HBV pgRNA在其5’和3’端的茎环结构处各有一个m⁶A修饰位点，通过此前的研究，作者认为5’端的m⁶A修饰增加了pgRNA的逆转录效率，3’端的m⁶A修饰则降低了HBV RNA的稳定性。
在这项研究中，作者进一步探究了m⁶A修饰的HBV转录本在调节宿主固有免疫反应中发挥的作用，证明了YTHDF2识别病毒RNA上的m⁶A修饰，抑制了RIG-I信号通路的激活，进而抑制病毒感染后的固有免疫应答，为病毒的宿主免疫逃逸机制提供了新思路。
1、 m⁶A甲基转移酶抑制固有免疫反应
作者在1.3× HBV质粒的基础上构建了5’和3’端m⁶A修饰位点（A1907）的单突变和双突变质粒（图1A）。后续实验发现，与野生型1.3× HBV质粒相比，转染5’端A1907C突变的1.3× HBV质粒后细胞内的磷酸化IRF3水平上升（图1B）。由于茎环结构中m⁶A位点的突变导致其茎环中的碱基对不匹配，因此A1907C突变可能会使茎环的二级结构发生畸变（图1C），作者进一步构建了茎环对应位点U突变为G使茎环结构碱基匹配的质粒（CM），转染后发现IRF3的磷酸化情况与5’ A1907C突变的质粒没有统计学差异（图1C&D），基本排除了5’端A1907C突变所致IRF3的磷酸化水平升高是由于茎环结构的变化所致的可能性。作者进而发现，在转染了1.3× HBV的HepG2细胞中敲减METTL3/14也可使IRF3的磷酸化水平增加（图1E），而过表达METTL3/14使IRF3的磷酸化水平降低（图1F）。结合已有的有关RIG-I主要识别pgRNA的5’端以激活先天免疫应答的研究报道，提示pgRNA 5’端的m⁶A修饰可能影响RIG-I信号转导。
图 1 HBV pgRNA的m⁶A修饰影响IRF-3的激活
2、病毒RNA的m⁶A修饰调节RIG-I的识别
作者在RIG-I缺失的细胞中转染野生型及5’端A1907C突变的1.3× HBV质粒，发现在缺乏RIG-I的情况下，HBV质粒转染并不会诱导IRF3的磷酸化升高（图2A），提示病毒RNA的m⁶A修饰可能是通过RIG-I信号通路来影响干扰素相关信号。由于RIG-I的沉默抑制了HBV诱导的IRF3磷酸化水平变化，作者进一步检测了m⁶A修饰是否影响病毒RNA和RIG-I之间的相互作用。作者将flag标记的RIG-I蛋白分别与1907位点单突变或双突变的1.3× HBV质粒共转染，并使用抗flag抗体进行RNA免疫共沉淀。结果发现，5’端A1907C突变后RIG-I上富集的pgRNA水平增加（图2D），提示5’端的m⁶A修饰在逃避RIG-I识别pgRNA的过程中起关键作用。
图 2 pgRNA的m⁶A位点突变增加了RIG-I与pgRNA的相互作用
3、YTHDF2和YTHDF3蛋白影响RIG-I信号通路
已有研究报道YTHDF家族的蛋白属于m⁶A 阅读器蛋白，能够识别并结合m⁶A修饰的RNA，调节其稳定性及翻译。因此，作者进而研究了YTHDF家族蛋白是否通过与m⁶A修饰的病毒RNA相互作用影响HBV刺激后的RIG-I信号转导通路。如图3A、3B所示,过表达YTHDF2和YTHDF3使1.3× HBV质粒诱导的IRF3磷酸化水平降低，而在转染5’端A1907C突变的1.3× HBV质粒后，YTDHF蛋白的上述作用消失。此外，在转染1.3× HBV质粒细胞中，敲减YTHDF2和YTHDF3可以增加IRF3的磷酸化水平，而在转染5’端A1907C突变的1.3× HBV质粒细胞中，敲减YTHDF2和YTHDF3不影响IRF3的磷酸化水平（图3C&D）。以上结果提示YTHDF2和YTHDF3可通过与m⁶A修饰的HBV RNA相互作用来调节宿主免疫应答。
图 3 YTHDF2和YTHDF3抑制由HBV刺激产生的IRF3介导的免疫应答。
4、病毒RNA的m⁶A修饰通过招募
m⁶A 阅读器蛋白抑制RIG-I的识别
为了进一步验证YTHDF2蛋白是否影响RIG-I对病毒RNA的识别，作者在细胞中敲减YTHDF2并过表达FLAG-RIG-I和1.3× HBV质粒。RNA免疫共沉淀实验发现，敲减YTHDF2后RIG-I与HBV WT pgRNA的相互作用增加（图4A）。然而敲减YTHDF2并不影响RIG-I与5’ m⁶A位点突变的HBV pgRNA的结合。以上结果说明，YTHDF2通过与m⁶A修饰的病毒RNA相互作用，抑制RIG-I对病毒RNA的识别，抑制RIG-I介导的宿主免疫应答。
图 4 敲减YTHDF2后RIG-I对HBV pgRNA的识别增加。
总结
在该研究中,通过分别沉默甲基转移酶(METTL3/14)和YTHDF蛋白，以及使用m⁶A缺陷突变体，揭示了HBV病毒RNA上m⁶A修饰对宿主抗病毒免疫反应的影响及机制。证明YTHDF蛋白是一种与m⁶A修饰的pgRNA结合的m⁶A阅读器蛋白,可竞争性抑制RIG-I对病毒RNA的识别，抑制下游的IFN表达（图5）。
图 5 病毒RNA的m⁶A修饰可抑制宿主固有免疫反应。
Kim GW, Imam H, Khan M, Siddiqui A. N6-Methyladenosine modification of hepatitis B and C viral RNAs attenuates host innate immunity via RIG-I signaling. J Biol Chem. 2020;295(37):13123-13133. doi:10.1074/jbc.RA120.014260