柱层析—化学制药工艺学29
柱层析（column chromatography）技术称为柱色谱技术，是色谱法中使用最广泛的一种分离提纯方法。柱层析能够根据化合物对吸附剂的差异吸附（通过色谱柱的速率不同）来分离物质。该技术可用于从微克到千克的规模。柱层析的主要优点是该方法中使用的固定相的成本相对较低且易于处理。值得注意的是相比于其他提纯方法（蒸馏、重结晶、打浆纯化等），色谱柱的分离效率不高，并不适用于大规模的工业生成。但利用硅胶短柱实现快速过滤操作在化学制药反应后处理操作中非常常见，其可以快速除去粗产品中的极性极大（水、无机盐）或者极性极小的物质。
柱层析相关术语解释
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流过层析柱的有机溶剂 |
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固定相（硅胶、氧化铝、离子交换树脂） |
层析柱填充物 |
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洗脱 |
洗脱液通过层析柱分离产物的过程 |
1 柱层析分离原理
当将流动相与需要分离的混合物一起从塔顶引入时，混合物中各个组分的运动速率不同。与固定相具有更高的吸附性和亲和力的物质移动得更快。快速移动的组分首先被清除，而缓慢移动的组件最后被洗脱。溶质分子到色谱柱的吸附是可逆的。化合物的移动速率表示为：
Rf(延迟因子)=溶质行进的距离/溶剂行进的距离。
不同组分分离的原理：分析物的各种组分对固定相和流动相的亲和力不同（粘附强度）导致组分的分离。亲和力又取决于分子的两个特性：“吸附”和“溶解度”。我们可以将吸附定义为混合物中的一种成分粘附到固定相上的性能，而溶解度则是该混合物中的一种成分溶解在流动相中的性能。固定相的吸附程度越高，分子穿过色谱柱的速度就越慢。流动相中的溶解度越高，分子穿过色谱柱的速度越快。分子的吸附和溶解度可以通过选择合适的固定相和流动相来控制。
为什么不同的化合物对固定相和流动相的亲和力不同？化合物的极性决定了它们对固定相和流动相的亲和力。化合物极性越大，吸附能力越强，所需要的洗脱溶剂的极性就越强，洗脱时间越长。层析柱越长、直径越大、装样量越大。常见溶剂的极性顺序：烃类 < 氯代烷烃、醚 < 酮、酯 < 醇、胺 < 水
2 柱层析基本操作
固定相应具有良好的吸附性能并满足以下条件：（1）颗粒应具有均匀的形状和大小，直径范围为60–200目；（2）高机械稳定性和化学惰性；（3）不会与酸或碱或任何其他溶剂发生反应；（4）无色、廉价易得；（5）允许流动相自由流动；（6）适合分离各种化合物的混合物。
(1) 装柱
色谱柱的装填主要有两种方法：干法和湿法装填。干法装填：首先往柱体装入干燥的固定相粉末，然后自顶部加入流动相溶剂，冲洗直至整个固定相被溶剂浸没。湿法装填：首先将固定相和流动相溶剂混合制成悬浊液，关闭色谱柱旋塞，柱体竖直，均匀地将悬浊液倒入，注意不能产生气泡。倾倒最好一次完成，否则固定相间断层影响分离效果。等待片刻，固定相沉降，有时用塑胶球轻敲柱体帮助固定相堆积密实。装填完成后顶端自然留有一段溶剂。
固定相装填完毕后，通常在其顶端铺上一小层硅藻土、玻璃纤维或棉花等材料，用来保护固定相顶层的形状不被流体搅乱。
(2) 加样
(3) 洗脱
(4) 定性与定量分析
柱层析的注意事项
① 柱层析的关键是发展一种能够使产物和杂质有效分离的层析系统。
② 可以用气体加压或者负压的方式提高层析效率。
③ 柱层析需要大量使用有机溶剂，应保持通风并设置接地线放静电。
3 离子交换色谱法
除了常见的吸附色谱法（固定相为SiO2和Al2O3），离子交换色谱法也在化学制药领域有一定的应用，如氨基酸和蛋白质的分离纯化。离子交换色谱系利用被分离组分与固定相之间离子交换能力的不同实现分离纯化。离子交换色谱的固定相为离子交换树脂，其分子结构中含有大量可解离的活性中心，待分离组分中的离子与这些活性中心发生离子交换，从而实现离子的分离纯化。