速看！5 分SCI免疫研究生信思路赶快学起来！
生信文章以“短平快”的优势，越来越被广大科研er青睐。今天就为各位医学童鞋安排解读2021年10月最新发表在Frontiers in Molecular Biosciences（IF=5.246）期刊上的文章。研究发现免疫相关基因对信号可以有效地评估肝癌的整体生存率，并能提供免疫检查点治疗反应性与靶向药物敏感性之间的关系。大家赶快一起学起来，开辟生信研究的新思路！
题目：Development and Verification of an Immune-Related Gene Pairs Prognostic Signature in Hepatocellular Carcinoma
肝癌免疫相关基因对预后标志的发展与验证
目的：随着肝癌(HCC)发病率的增加和免疫治疗预后不良，对患者的个性化管理和治疗需要可靠的免疫相关基因对(IRGPs)预后特征。
方法：从TCGA和ICGC数据库中获取肝癌患者的基因表达谱和临床信息。免疫相关基因对是利用免疫相关基因(IRGs)构建的，变异很大。采用LASSO回归分析构建免疫相关基因对标签。通过ICGC队列验证了免疫相关基因对标签。从90个变异率高的免疫相关基因构建了1309个免疫相关基因对。
结果：作者的研究获得了50个与预后显著相关的免疫相关基因对，并构建了一个包含17个免疫相关基因对的标签。在TCGA和ICGC队列中，根据免疫相关基因对特征将患者分为高危组和低危组。低危患者的总生存期明显长于高危患者。经临床和病理因素调整后，多因素分析显示免疫相关基因对信号是一个独立的预后因素。ROC曲线验证了标签的准确性。此外，基因集富集分析(GSEA)显示，其特征与免疫生物学过程有关，不同危险患者的免疫微环境状况不同。
结论：作者的研究提出的免疫相关基因对信号可以有效地评估肝癌的整体生存率，并能提供免疫检查点治疗反应性与靶向药物敏感性之间的关系，从而为肝癌的诊断和治疗提供新的思路。
1. 数据的获取和整理
从TCGA数据库下载肝癌水平3 RNA-seq数据和临床资料，包括正常组织(n=50)和肿瘤组织(n=374)。365例肿瘤患者有生存时间和生存状态，其中247例患者的临床资料(年龄、性别、组织学分级、TNM分期、血管浸润、甲胎蛋白)。
从ICGC数据库下载肝癌的RNA-seq数据和临床资料，其中包括正常组织202例和肿瘤组织243例。232例肿瘤患者有生存时间、生存状况和临床资料(年龄、性别、TNM分期)。免疫相关基因对的列表是从IMMPORT下载的。
2. 免疫相关基因对标签的构造与定义
主成分分析(PCA)首先对这两个群体的表达谱进行了分析。结果表明，两组数据中肿瘤组织和正常组织的分布存在差异，可供进一步分析。在TCGA队列中鉴定出231种差异免疫相关基因对，在ICGC队列中鉴定出172种差异免疫相关基因对。作者获得了120个共享的差异免疫相关基因对，并将它们显示在蛋白-蛋白质相互作用网络中(图1A)。为了获得高变异的基因，作者在120个免疫相关基因对中进行了筛选。筛选标准是肿瘤样本中这些基因的绝对误差中位数大于1.90，最终构建了1309对免疫相关基因对。在TCGA队列中评价这些免疫相关基因对与总生存率的相关性，筛选出50例与预后相关的免疫相关基因，以P<0.001为切断标准(图1C)。通过LASSOCox比例风险回归，在TCGA队列上构造了一个由17个免疫相关基因对组成的标签。免疫相关基因签名由22个唯一的免疫相关基因组成。最后，利用时间依赖的ROC曲线确定风险评分的最佳临界值为0.210，将患者分为高危或低风险患者(图1B)。此时，敏感性为74.1%，特异性为75.5%。在TCGA队列中，高危患者与组织学分级、Child-Pugh分级、甲胎蛋白、血管浸润和TNM分期有显著的相关性(表1)。高危组患者的总体生存率低于低危组(图2A)。PCA分析表明，不同风险患者的分布模式是对比的(图2B)。ROC曲线评估预后标志的预后能力，1年时曲线下面积为0.809，2年为0.757，3年为0.712(图2C)。
3. 免疫相关基因对标签预测生存的可行性验证
为了确定标签是否具有预测价值，将标签作为独立的外部验证应用于ICGC队列。根据上述风险评分将ICGC患者分为高危组和低危组。ICGC组高危患者也与TNM分期相关(表1)。同时，高风险组患者的总体生存率低于低危组(图2D)。PCA分析显示两组患者的分布模式不同(图2E)。此外，1年的ROC曲线为0.772，2年为0.744，3年为0.759(图2F)。
4. 免疫相关基因对标签作为独立预后因素
在TCGA组中，单因素COX分析显示TNM分期、血管浸润、免疫相关基因对信号与肝癌的预后密切相关。经年龄、性别、组织学分级、TNM分期、血管浸润、甲胎蛋白等临床病理因素调整后，TNM分期和免疫相关基因对信号是多因素Cox分析的独立危险因素(图3A)。同样，在ICGC队列中，单因素COX分析显示，TNM分期和免疫相关基因对信号也与肝癌的预后密切相关。多因素Cox分析显示，TNM分期和免疫相关基因对信号也是影响整体生存的独立危险因素(图3B)。在TCGA和ICGC队列中，高、低风险患者在TNM阶段的分布不同。此外，免疫相关基因对标志将早期(I和II)和晚期(III和IV)肝癌患者分为不同的预后组。另外，对于Ⅱ期疾病的患者，低风险患者在TCGA队列和ICGC队列中都有良好的预后。同样，对于Ⅲ、Ⅳ期晚期患者，低风险患者在TCGA队列和ICGC队列中也有良好的预后。总的来说，免疫相关基因对的签名似乎能够独立地评估肝癌的整体存活情况。
5. 功能诠释与高危和低危患者免疫细胞浸润
GSEA结果表明，某些免疫相关的生物学过程参与了高危患者，如天然免疫反应的激活、抗原的加工和MHCⅠ类抗原的递呈、活化的T细胞增殖的阳性调节、I型干扰素介导的信号通路的调节等。有趣的是，某些免疫相关的KEGG通路在高危患者中富集，如FC epsilon RI信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、NOD样受体信号通路。这些结果表明，免疫相关的生物学过程可能在肝癌的发生发展中起着不可或缺的作用。作者进一步探讨了高风险和低风险人群中免疫细胞和免疫相关功能的状况。在TCGA队列中，高危患者与肿瘤浸润免疫细胞(aDCs、巨噬细胞、TH2细胞、Treg)呈正相关，与Mast细胞、中性粒细胞和NK细胞呈负相关(图4A)。在ICGC组中，除Mast细胞无统计学意义外，其结果与TCGA的结果一致(图4C)。在TCGA队列中，高危患者与MHCⅠ级呈正相关，与Ⅱ型IFN反应呈负相关(图4B)。在ICGC队列中，获得了相同的结果(图4D)。
6. 免疫检查点治疗的反应性与靶向药物的敏感性
免疫检查点治疗在肿瘤治疗中取得了较好的效果，在肝癌领域取得了重大突破。因此，作者研究了免疫检查点标记在低风险和高危患者中的表达情况。在TCGA和ICGC队列中，免疫检查点标记(CD276、HHLA2、TNFRSF18、TNFSF9、LGALS9)在高危患者中表达较高，且免疫相关基因对标记与这些标记呈正相关(图5A-E)。目前已批准的酪氨酸激酶抑制剂已在临床试验中证明了治疗肝细胞癌的有效性，这有助于肝癌患者的治疗和治疗。因此，我们评估了每个样本的IC50，并观察到八种小分子酪氨酸激酶抑制剂的IC50在两组间有显着性差异。结果表明，Axitinib、motesanib、Dasatinib、Nilotinib、Erlotinib、Pazopanib、Lapatinib和saracatinib对低危患者更为敏感(图6A-H)。这可能为肝癌患者的治疗提供一个准确的策略。
本研究提出的免疫相关基因对信号可以准确地预测肝癌患者的预后，指导临床医生做出具体的治疗决策。还提供了与免疫检查点和目标药物的反应之间的关系。