血培养技术诊断菌血症的最新进展与质量控制
摘要
血流感染是指各种病原微生物侵入血循环，在血液中繁殖、释放毒素和代谢产物，并诱导细胞因子的释放，引起全身感染、中毒和全身炎症反应，进而进一步引发血压下降、导致凝血和纤溶系统的改变，从而引起全身多器官功能障碍，这是一种以高发病率和死亡率为特征的严重疾病[1]，因此病原微生物的快速检测十分关键。另外通过指导临床医生调整抗感染治疗，可以避免无效治疗，减少抗感染治疗的范围。比如限制耐药菌株的选择，以及限制选择某些广谱抗生素或联合治疗可能会对有益菌产生毒性和负面影响。再则，一般来说血液中的微生物含量比较低，可低至1-10CFU/ml，检测的难度很大。所以找到血培养高度敏感，易于操作，迅速确定血液感染病因的方法一直是我们努力的方向。此外，含有丰富营养物质的标准瓶通常被用来进行血培养，从而检测需氧菌和厌氧菌的生长。标准的培养时间一般是5天，可让大部分微生物恢复活力，包括一些苛养菌。有时候也需要适当增加培养时间使生长较慢的微生物达到仪器自动报警的检出限，比如真菌和分枝杆菌[2]等。为了提高血培养的检测能力，研究人员从开发自动培养仪[3-5]，调整培养基的成分[6, 7]来提升效率，通过规范采样技术，引进计算机先进算法，利用分子检测手段[8]来减低标本的污染率，去除人为的判断，加强菌种的鉴定能力。
一
血培养最新进展
1. 血培养仪器：血培养方法经历从手工、半自动（放射性）、侵入性半自动、非侵入性全自动、高度全自动的发展历程。传统手工法是将血液标本置于增菌肉汤中孵育，肉眼判断是否有细菌生长，频率为每天1次，有生长迹象进行镜检和转种，否则继续孵育，一般为7天。手工检测敏感度较低，受主观因素的影响，且不能及时发现阳性标本。随后人们逐渐把重点放到了自动化培养和检测技术的升级中。现代化的实验室一般依靠自动培养仪来监控病原微生物的生长情况。检测原理一般基于病原微生物生长代谢产生的二氧化碳浓度变化来监控微生物的生长情况。早期的半自动血培养仪先后通过14C标记培养基，红外线穿刺检测等来实现，但因为放射性安全、“有创性”检测引入外界污染等缺陷，血培养检测效率依然较低[9]。1985年Dr. Thurman Thorpe及其团队发明可以用于检测细菌生长的内部检测传感器,提出“非侵入性”血培养检测理念。1989年生物梅里埃公司（bioMérieux）开发了全球首台BacT/ALERT 3D全自动培养仪，通过监测微生物代谢产生的二氧化碳引起含有标本的培养瓶的底部感应器发生的颜色变化（由灰变黄），随之处理以图像及声音进行警示，Bact/ALERT与主服务器相连可使测试功能进一步自动化[9]。随后美国BD公司研发的BACTEC™ FX血液自动培养仪利用了产生的二氧化碳导致荧光的变化来检测微生物生长情况，其可远程获得的实时培养结果，从而提高临床决策和实验室工作流程。
近年生物梅里埃公司推出的新一代VIRTUO全封闭自动化培养系统，与BacT/Alert 3D系统，BACTEC FX等上一代培养系统相比，整合上、下载、标签扫码等更多手工步骤为自动化运行，避免因为频繁开合箱体引起的培养温度波动。VIRTUO的全封闭式箱体可维持恒定培养温度（35-37℃），更有利于促进微生物的生长。同时Virtuo改进传统斜率算法为RAUC（曲线下面积）、R2R（读数读取变化）和EI（早期读数分析）三种算法结合，更快地检测微生物是否报阳。相比于3D系统[10-12]和BACTEC FX系统[13-16]，可缩短20%检测时间（time to detection）[17-18]。Miller N等比较VIRUTO与3D系统在8种常见病原体检出时间差异，VIRTUO检测需氧和兼性厌氧微生物的时间明显缩短，平均减少约3小时，脆弱拟杆菌TTD差异最大，中位改善为46.7小时[11]。Liottie FM等针对BACTEC FX，3D和VIRTUO系统的评价发现，按菌种区分VIRTUO至少可节省2小时报阳时间。同时因为VIRTUO独有的自动上、下载功能，比较血培养瓶操作过程BACTEC FX系统需要11步，而VIRTUO仅需1步，大大节省血培养手工操作[19]。
2. 血培养瓶成分的研究进展：在自动培养仪发展的基础上，调整培养基成分也是提高感染病原微生物的检出效率的重要因素。已经接受抗生素治疗的病人血液标本中会含有抗生素，导致血培养过程中病原菌生长速度缓慢，错过最佳的抗感染治疗调整时机。培养基中加入活性碳或树脂可以帮助中和取样前的抗生素，从而帮助更快的检测到微生物的复苏[20]。活性碳血培养瓶以生物梅里埃生产的BacT Alert FAN为代表。根据文献报道活性碳瓶相比于未添加抗生素中和剂的标准血培养瓶能提高阳性率[6, 7]。尽管在检测时间上活性碳瓶和标准瓶没有明显差异，但是在金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、酵母菌等的检出率上，活性碳瓶有明显优势[7]。
树脂血培养瓶以美国BD公司生产的BACTEC Aerobic/F Plus和生物梅里埃近年新上市的BacT/ALERT FAN Plus为主要代表。其中BacT/ALERT FAN Plus还添加能够吸附碳青酶烯类抗生素的专利化学吸附剂[21]。树脂瓶显示比活性碳瓶更佳的病原菌检出性能和更短的报阳时间，其中在1507例需氧瓶和2386例厌氧瓶对比试验中，BacT/ALERT FA plus和FN plus均显著提高金黄色葡萄球菌和总微生物的生长恢复，相比活性碳瓶检出时间缩短2-2.4小时[22]。Chen IH等利用体外模拟验证不同品牌树脂瓶生长性能发现，BacT/Alert FA plus与Bactec Aerobic/F Plus瓶接种抗生素与铜绿假单胞菌检测时间相似，而在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中BacT/Alert FA plus培养时间更短。BacT/ALERT FN plus瓶比BACTEC Anaerobic/F Plus瓶在美罗培南和亚胺培南回收上有更好效果，整体恢复率更高[23, 24]。Lovern D等利用反相高效液相色谱评价不同树脂血培养瓶中的抗生素结合及细菌生长动力学研究显示，BacT/ALERT FA PLUS针对β-内酰胺类抗生素，喹诺酮类，达托霉素，头孢洛林等吸附速率显著优于BACTEC Anaerobic/F Plus[25]。Fiori B等开展1032套血培养前瞻性临床比对发现，BacT/ALERT FAN plus相比BACTEC Plus树脂瓶，对阳性球菌、阴性菌检出率更高，整体报阳时间无显著性差异，但对于治疗失败（经验性治疗无法覆盖病原体）的血培养组，BacT/ALERT FAN plus瓶的检出时间更短[26]。
3. 病原菌的分离和鉴定：确定阳性血液标本之后进行病原菌的鉴定对后续有针对性的治疗也十分关键。目前的鉴定方法可以分为以下几种，亚培养获取纯菌落，新型的阳性血样的分子检测法。
（1）亚培养获取纯菌落：可以进行短时间的亚培养来获得纯菌落，从而进行传统的生化检测，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质量光谱法（MALDI-TOFMS），PCR和基因测序。
（2）新型的分子检测法：核酸扩增法是最常用的鉴定病原体的方法。多聚PCR使用通用引物靶向细菌（16S）或真菌（18S）基因组的保守rDNA区域，随后通过测序属/种特异性实时PCR检测对微生物进行鉴定，比如脓毒症流芯片（Master Diagnostica）和ePlex®。原位杂交法利用两个互补核酸链的特异性结合，其中一个探针是已知的核酸序列，另一个是未知微生物基因组的一部分。特异性的结合可以被荧光显微镜捕捉到，包括PNA-FISH®，QuickFISH®，AccuProbe®，Accelerate PhenoTM等。DNA微阵列杂交法由固定在固体表面的短寡核苷酸组成，同时、并行地检测许多病原体及其抗菌素耐药基因。DNA微阵列所覆盖的物种一般约占已知引起血流感染的病原体的90-95%，其敏感性在10^1-10^5细胞/mL之间[8]。
4. 血培养瓶报阳后的直接药敏试验：血培养瓶报阳后，由于不能对血培养瓶中细菌数量按药物敏感性试验要求进行标准化，其次用来检测的少量血液混合物样本可能含附加剂（如血液中的抗菌药物、抗凝剂和其他附加剂）等因素影响，一般不建议做直接药敏实验，尽管该方法可减少结果报告所需的时间。近年来，血培养瓶报阳后，直接快速的抗菌药物敏感性试验有了如下进展：
（1）EUCAST：于2018年11月28日发布阳性血培养快速药敏方法（RAST），包含了短时间培养方法及抑菌圈直径折点表用于判定结果，于2019年05月02日进行了修订。其操作方法：当血培养报阳后，报阳后0-18小时后的血培养瓶适用于此方法，在进行测试前无需提前从血培养仪中取出血培养瓶，从血培养瓶中直接取:125±25µL，可使用3方向擦拭涂布的标准方法或平板旋转器进行接种并涂布MH平板完成药敏接种，并贴上抗菌药物纸片，35℃培养。在孵育4，6，8小时后分别读取药敏结果，不同的孵育时间有相应的折点和结果解释标准，从培养基正面量取抑菌圈直径。需要注意事项：可直接使用血培养阳性瓶中的液体进行接种，无需离心或稀释；目前适用的血培养瓶包括（BACTEC，Bact/ALERT和Thermo）；只有存在明显抑菌圈边缘时，才能量取，否则需要延长孵育时间；平板孵育及判读时间不应超过8小时；使用血培养报阳后直接药敏测试（RAST）的折点而非常规EUCAST细菌耐药折点。在进行结果解释时，需要进行鉴定，根据鉴定结果选择合适的表格进行结果解释。目前只有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌和屎肠球菌有结果解释标准：也就是说折点仅适用于规定的菌种和孵育时间，不适用于表中未包括的菌种和/或孵育时间，同时确保质控结果在控。
（2）Accelerate Pheno检测系统：2017年2月，FDA批准Accelerate Diagnostics公司销售Accelerate Pheno system和Accelerate PhenoTest BC (血培养)试剂盒，用于从阳性血培养标本中直接鉴定14种常见病原菌和AST，以及直接鉴定两种念珠菌（仅用于鉴定）。Accelerate PhenoTest BC试剂盒，包括48个流动池通道，可装载5ml阳性培养液。每个盒子内包含两个凝胶电泳站和荧光原位杂交探针（用于鉴定）、抗菌药物和其他必需的试剂（用于自动标本制备、对目标细菌和真菌进行鉴定以及对目标细菌做AST）。对于每个标本来说，Accelerate PhenoTest BC试剂盒加载的总劳动时间小于10分钟。用形态动力学（细胞形态学、质量、分裂速率、异质性、细胞的异常生长模式和微菌落）细胞分析方法作为时间推移图像来分析子代克隆，图像分析软件生成生长概率评分以及MICs基于祖细胞向子代细胞克隆生长速率。仪器通过使用软件从测量参数中计算出MIC值，并应用基于2016 CLSI和FDA折点的专家规则。应将检测结果结合革兰染色结果一起解释。Charnot-Katsikas等人在临床微生物实验室内通过连续对232瓶新鲜阳性血液培养中的241株病原菌（223瓶为单一病原菌和9瓶多个病原菌）进行检测来评价。在抗菌药物敏感性检测方面，与常规方法相比，总的基本一致率为95.1%，分类一致性为95.5%。与标准流程相比，Accelerate Pheno system对病原菌鉴定的时间和AST的时间分别减少了23.47h和41.86h[27]。
二
血培养的质量控制
1. 污染率：研究报道的最多的血培养质量指标是污染率。一般建议血培养的污染率应保持在或低于 3%。血液标本污染会造成培养结果的假阳性，从而导致严重的后果。因此降低污染率会提高血培养检测的特异性，为随后的治疗提供更好的保障。目前已经被确认可降低污染的步骤包括皮肤消毒准备工作、培养瓶的消毒、瓶接种使用单针和双针、使用专门的抽血小组，使用商业血液培养采集试剂盒等。由于皮肤通常被认为是最可能污染血样的来源，所以可采用聚乙烯吡咯酮碘，碘酒，含酒精的产品作为皮肤消毒的主要物质。但是即使采用皮肤消毒也是不能绝对完全防止皮肤菌群对于血液培养的污染，因为检测到多达20%的皮肤相关细菌可在消毒后仍具有存活能力。大量的历史数据显示皮肤消毒剂并不像氯己定一样有效。使用氯己定需要进行培训, 以实现有效的皮肤消毒, 另外采用双针，即丢弃用于抽取血液培养物的针，使用新的针来进行接种被认为是可以减低污染率[28]的有效方法。
既然无法完全消除标本污染的概率，那么鉴定假阳性和菌血症成了另一个挑战。临床医生通常采用以下方法进行鉴别：1）菌种鉴定。常规上金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌等肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等通常被认为是导致菌血症或真菌血症的菌种。而凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌种类、炭疽杆菌以外的芽孢杆菌种类、痘丙酸杆菌、微球菌种类、绿藻群链球菌、肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌等则通常被认为是污染菌。2）阳性血培养的套数。多套阳性培养瓶长出了同一个菌种，说明是菌血症。但是如果仅一套培养长出了通常被认为是污染源的菌种，则被认为是假阳性。3）在一套血培养中的阳性瓶数。仅一个培养瓶长出微生物，说明假阳性的概率很高。4）培养时间。菌血症组的菌量通常比污染组的大，所以真阳性组的培养时间通常较短。5）数据分类技术的引进。感染控制活动是高度数据密集的，卫生保健信息技术为改进监测和报告系统的效率提供了巨大的潜力。针对血液培养污染的挑战，研究人员已经探索了采用自动的、基于计算机的算法对培养结果进行分类，从而辨别可能的污染物或病原体。在大量的血培养数据基础上，结合病人的生命体征和用药数据来建立预测模型，其准确度通常可以达到，甚至超过感染控制人员的判断水平。这种方法至少有两个潜在的好处：在面对不明确的培养结果时协助临床解释和决策，以及为医院感染和血流感染率的监测提供客观的、可重复的、成本效益高的方法[28]。
2. 采血量：采血量是决定血培养检出率关键变量[29]，对于检测脓毒症的病原菌来说，抽足量的血标本比抽血时间更重要。Donnino MW等研究发现多数血培养瓶采血量一般低于指南推荐[30]。采血量过少会影响阳性检出率，过多血细胞的呼吸作用会造成假阳性等。目前，三甲评审检查内容分类汇总（检验科），除查危急值报告制度和流程（血培养危机值回报）外，还查标本验收标准（血量检查）；CNAS CL02医学实验室质量和能力认可准则中，原始标本采集的类型和量要求实验室应定期评审静脉穿刺取血（及取其他标本如脑脊液）所需的标本量，以保证采样量符合要求；CAP认证要求除血培养污染率外，也要求血量检测。
血培养瓶中有足够的采血量，如果采血量不在规定的范围内, 应告知送检医生和护士, 并建议重新采集血培养。常用评估采血量有肉眼观察法及称重法。尽管肉眼观察操作起来很容易, 但因培养瓶的壁厚、人主观判断等因素, 因此该方法有一定误差。相比之下, 称重和与已知标准比较重量更为客观。目前自动化血培养系统可提供的血量监测技术包括BACT FX系统通过Epicenter中间件利用血细胞代谢批量（25瓶/批）间接测量血容量[31]，VIRTUO则通过直接液面测量实时监测单瓶采血容量[17]。VITRO还可以对不同科室的采血量进行统计，此数据对护士规范化采血培训很有帮助。
3. 血培养的套数：另一项常用的质量评估指标是每次败血症期采集血培养的套数。采集的套数应该遵循我国卫生行业标准2019年发布《临床微生物检验标本的采集和转运》。如果已在抗菌药物治疗之前抽取了多套血培养，当患者使用抗菌药物后还是同样高热发作时不建议再作血培养，因为再做的血培养罕见有阳性结果。血培养真正的阳性率应该在6-12%范围内，如果过低，可能同一患者送检血培养次数过多，阳性率过高，则说明送检的血培养数量多于推荐量，不符合血培养送检要求。
三
结 论
血流感染是一种高发病率，高死亡率的疾病。血培养具有多种临床作用——预后、指导治疗、监测疗效、流行病学分析，在短期内,任何新技术都不可能完全取代血培养。目前普遍使用的自动培养仪进行血培养的方法，在仪器自动化功能，血培养瓶成分改进方面均有较大的发展，极大程度优化传统血培养流程，提高了检测效率。但依然存在标本污染现象，导致一定假阳性率。在加强质量控制的基础上，使用先进的分子鉴定技术和以计算机为基础的大数据分析手段为未来实现快速和高效的诊断提供发展方向。新技术和血培养正被整合成为一种检测策略，且两者都能发挥各自的优势。
参考文献略
注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题