组织学技术 脱钙切片标本制作

含钙的组织，骨、牙

1 脱钙剂

常用：硝酸、盐酸、硫酸、甲酸（蚁酸）、枸橼酸（柠檬酸）、三氯醋酸（三氯乙酸）、乙二胺四乙酸（EDTA）

最常用的无机酸为硝酸，最常用的有机酸为EDTA。

（1）硝酸

脱钙快，效果好

一般用5%硝酸水溶液，不超过10%

2毫米厚的骨片脱钙2~3天

（2）甲酸

良好的脱钙剂。脱钙较慢，对骨组织结构破坏较轻

2~3毫米厚骨片，松质骨约48小时，密质骨7~10天，经常换液

染色效果比硝酸好

脱钙时加入尿素等试剂，防止纤维性组织过度肿胀而使组织受破坏

（3）乙二胺四乙酸（EDTA）

很好的脱钙剂，对组织破坏极小，长期脱钙也无明显破坏

脱钙后的染色效果好

脱钙时间长。2周以上甚至3个月。加温至37℃可加快脱钙

常用15%水溶液。

2 脱钙液

（1）单纯脱钙液：一种脱钙剂

浓硝酸5毫升，尿素3~5克，蒸馏水100毫升

浓硝酸5毫升，甲醛5毫升，甘油5毫升，蒸馏水100毫升

浓甲酸50毫升，70%酒精 50毫升

5%甲酸水溶液5毫升，蒸馏水95毫升

三氯醋酸5克，10%甲醛100毫升

浓盐酸15毫升，氯化钠175克，蒸馏水1000毫升。用时每200毫升每天加浓盐酸1亳（von Ebner）

EDTA15克，蒸馏水100毫升

（2）混合脱钙液

枸橼酸甲酸液：

枸橼酸钠结晶10克，90%甲酸25毫升，蒸馏水75毫升

甲酸三氯醋酸液：

85%甲酸50毫升，95%酒精 50毫升，枸橼酸钠结晶10克，三氯醋酸0.5克，蒸馏水50毫升

3 脱钙基本方法

⑴取新鲜骨固定于10%甲醛水溶液或稍久。

⑵脱钙（针刺能顺利进入组织），充分水洗（中止脱钙）。

⑶入5%硫酸钠水溶液12~24小时（中和），流水冲洗过夜。

⑷脱水、透明、浸蜡、包埋、切片

50%、70%、80%、90%、95%酒精、冬青油透明1、冬青油透明2、二甲苯洗去冬青油

（70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、正丁醇1、正丁醇2、软蜡、硬蜡、包埋、切片）

切片10微米左右。

⑸苏木精伊红染色。

4 骨组织脱水

一般脱水程序：

70%酒精1小时-->80%酒精1小时-->90%酒精1小时-->无水酒精正丁醇等量混合液2小时-->无水丙酮1小时-->正丁醇3小时

（1）先固定后脱钙的骨组织脱水

1) 70%酒精1小时-->80%酒精1小时-->90%酒精1小时-->95%酒精30分钟-->正丁醇 4~6小时-->浸蜡

2)直接入叔丁醇脱水兼透明3~5小时-->浸蜡

3)环乙酮脱水兼透明3~5小时-->浸蜡

4)三氯醋酸脱钙-->二氧陆环脱水2~3小时两次

(2)先脱钙后固定的骨组织脱水

无水酒精2~3小时,或无水酒精丙酮2~3小时

5 脱钙骨组织的透明

透明剂有苯（易挥发，有毒）、香柏油、氯仿、苯甲酸甲酯、冬青油-苯甲酸甲酯（5：3）

苯透明：与二甲苯相同

香柏油透明：12小时以上

氯仿透明：24~72小时甚至更长

苯甲酸甲酯透明12~24小时

冬青油- 苯甲酸甲酯：透明时间较长

6 骨组织浸蜡

用正丁醇脱水兼透明的骨组织，入正丁醇石蜡等量液3小时，石蜡3小时

用二氧陆环脱水兼透明的组织，入二氧陆环石蜡1：2（56℃）3小时，纯石蜡（56℃）3小时

苯透明的骨组织，苯-石蜡等量混合液2小时，浸蜡3小时

叔丁醇、环乙酮、氯仿等透明的骨组织，透明时间延长（1~2小时），直接浸蜡

香柏油透明的骨组织，经二甲苯洗涤后再浸蜡

包埋：采用56℃硬蜡

Lillie硝酸银染色法

⑴ 骨组织固定于10%甲醛溶液，蒸馏水洗。

⑵入2.5%硝酸银水溶液37℃浸4~5天，蒸馏水洗。

⑶用Von Ebner盐酸脱钙法或5%硝酸脱钙。

附：V on Ebner脱钙

盐酸4毫升，氯化钠饱和水溶液100毫升。牙齿加盐酸10~20亳升。每日加盐酸1~2毫升，至钙脱尽。入稀氨水中和。（Schmorl硫堇苦味酸染色法）

5%硝酸脱钙：

固定后的骨组织入5~7%硝酸水溶液至组织充分软化。对管状骨应换脱钙液。入5%硫酸钠中和24小时。自来水冲洗24小时，脱水，包埋。

⑷ Hansen苏木精或Weigert铁苏木精染细胞核。

⑸ 可用Van Gieson法复染胶原纤维。

⑹常规脱水、透明、封片。

结果：骨小管、骨陷窝、软骨中的钙化部分及硫酸钙沉积处呈黑色。

Bock苏木精伊红染色法

⑴ 组织固定于Müller液25毫升加5%甲醛100毫升8~10天。

⑵ 用Ebner盐酸脱钙或5%硝酸脱钙。

⑶5%钾明矾水溶液24小时或氯化钠半饱和水溶液6天。

　⑷ 流水洗1~2天。

⑸ 常规脱水，石蜡包埋，切片。

⑹Hansen苏木精染色12~18小时。

⑺ 甘油冰醋酸等量混合液分化5~20分钟或更久。

⑻  自来水洗1小时。

⑼入0.4%伊红70%酒精溶液5分钟。

⑽95%酒精和无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。

结果：钙化骨蓝色，无钙化骨红色。

Tappen脱钙骨组织镀银法（1965）

⑴取新鲜骨组织用10%甲醛固定，硝酸脱钙。充分水洗。

⑵硫酸钠或碳酸锂水溶液中和，水洗。

⑶ 入氨银液30~40小时或72小时，蒸馏水洗。

⑷氨银液：10%硝酸银水溶液5毫升加氨水至沉淀溶解，加蒸馏水至50毫升

⑸ 冰冻切片10~30微米。

⑹  脱水，透明，封片。

附：

Hansen苏木精：不需蓝化。细胞核、软骨蓝色。

甲液：苏木精1克，无水酒精10毫升

乙液：钾明矾20克，蒸馏水200毫升

丙液：高锰酸钾1克，蒸馏水16毫升

将甲液倒入乙液，加温，最后加丙液3毫升，煮沸1分钟，迅速冷却。

Weigert铁苏木精

甲液：1%苏木精酒精溶液100毫升

乙液：29%氯化铁水溶液4毫升，盐酸（25%）1毫升，蒸馏水95毫升

将二液等量混合。只能用几天。

方法：

⑴切片脱蜡，经各级酒精下行至蒸馏水，蒸馏水洗。

⑵Weigert苏木精染色数分钟，流水洗。

⑶若染色合适，不需分化，过染则用0.1%盐酸70%酒精脱色，流水充分洗涤。

结果：细胞核蓝色。

 Van Gieson法

Van Gieson液：苦味酸饱和水溶液100毫升，1%酸性品红水溶液5~10毫升

方法：

⑴组织固定于甲醛、Bouin液、Z enker液、Susa液，石蜡切片。

⑵Weigert苏木精或其它苏木精染细胞核，流水充分洗涤。

⑶Van Gieson液数分钟，用滤纸吸干。

⑷95%酒精分色至结缔组织成红色，肌组织黄色。

⑸无水酒精快速脱水，二甲苯透明，封固。

结果：细胞核深褐色，肌组织黄色，胶原纤维红色。

软骨基质染色

⑴透明软骨一块固定于Zenker液12~18小时，石蜡切片。

⑵切片脱蜡至水。

⑶2.5%铁明矾水溶液30分钟，水洗。

⑷Regaud苏木精50℃ 30分钟，蒸馏水洗。

⑸2.5%铁明矾水溶液分化至细胞清晰为止。

⑹自来水洗10分钟。

⑺1%酸性品红（1%醋酸酐）溶液5分钟，蒸馏水洗。

⑻1%磷钼酸溶液脱色至结缔组织退色而细胞质呈红色。

⑼入含2.5%冰醋酸的苯胺蓝水溶液2~5分钟，蒸馏水洗。

⑽入1%冰醋酸1~30分钟。

⑾入含0.1%酸酸的无水酒精快速脱水、二甲苯透明、封固。

Mallory三色染色法

⑴固定液用Zenker、Helly、Bouin液。甲醛固定的组织，切片需经Zenker或Bouin媒染。

⑵石蜡切片8微米以下。

⑶切片脱蜡经各级酒精下行至水。

⑷0.5%酸性品红水溶液5分钟，速洗。

⑸入苯胺蓝橘黄G液10~20分钟。

染液：苯胺蓝0.5克，橘黄G 2克，磷钼酸或磷钨酸1克，水100毫升

⑹95%酒精分色2~3次。

⑺无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果：胶原纤维深蓝色；软骨、骨基质、黏液等呈深浅不一的蓝色；细胞核红色；红细胞橘黄色；肌肉紫红色。

 Heidenhain Azan法

⑴新鲜组织固定于Zenker、Helly、Bouin、Carnoy液12~24小时。

⑵固定后冲洗，各级酒精脱水，透明，石蜡包埋，切片。

⑶切片经二甲苯脱蜡，各级酒精下行至蒸馏水。

⑷入1%苯胺（安尼林）95%酒精溶液30~60分钟。

⑸95%酒精1分钟。

⑹入0.1%偶氮卡红B或G水溶液37℃温箱染色8~12小时。

偶氮卡红液：偶氮卡红G1克，蒸馏水100毫升。用时取10毫升加蒸馏水90毫升，冰醋酸0.5~1毫升

⑺待切片冷后，用蒸馏水略洗。

⑻用0.1~1%苯胺酒精溶液分色至细胞呈深红色、肌纤维红色、其它纤维无色或微红色。

⑼入含1%醋酸95%酒精溶液快洗30~60秒，蒸馏水略洗。

入5%磷钨酸水溶液30~180分钟，蒸馏水略洗。

⑽苯胺蓝-橘黄G混合液染15~30分钟。镜检染色深浅，或改用0.25~0.5%水溶液染1~3小时。

染液：苯胺蓝0.5克，橘黄G 2克，蒸馏水100毫升，冰醋酸8毫升，混合煮沸，冷却过滤。

⑾流水洗去多余的染料。

⑿95%酒精分色，使苯胺蓝、橘黄G着色分明。

⒀无水酒精脱水1~2分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果：胶原纤维蓝色；肌纤维深红色；弹性纤维亮黄色；细胞核红色；红细胞橘黄色。