2020年的预后分数套路如何发4分+SCI
Gene signatures based on therapy responsiveness provide guidance for combined radiotherapy and chemotherapy for lower grade glioma基于治疗反应性的基因特征为低级神经胶质瘤联合放疗和化疗提供指导
一、 研究背景
低级神经胶质瘤（LGG）治疗指南一直缺乏关于RT和化疗的治疗时间和顺序的指导。RT在以往一直是不可切除和进行性LGG的主要治疗方法。但对于化疗敏感的患者，因为RT长期的毒副作用，现在往往倾向于延缓放疗。但是研究表明早期进行RT的预后比延迟RT要好。因此作者旨在开发指标以区分RT和化疗的不同受益者，为联合放化疗提供更准确的指导。对于RT和化疗均耐受的患者，作者也旨在研究其耐受机制并为其确定合适的治疗方法。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.确定RT和化疗的“应答者”和“无应答者”
作者以TCGA-LGG数据集（包含516个LGG）作为训练队列，CGGA的mRNAseq_693（包含282个LGG）和mRNAseq_325（包含144个LGG）数据集作为Rscore的验证队列。由于RNAseq_693缺乏CPA3基因的信息（Cscore公式的一部分），因此作者在验证Cscore时仅使用RNAseq_325。表1为三个数据集的临床信息。
对于RT，辅助RT开始后的复发和死亡被定义为“治疗相关事件”，从接受辅助RT开始到治疗相关事件发生的时间被定义为“tr-DFS”。在TCGA中，共选择了53例接受了RT，但未接受化疗的原发性LGG。根据tr-DFS对53位患者进行了排名，落在分布最左（10％）和最右（10％）的患者分别被定义为“无应答者”和“应答者”。化疗的“应答者”和“无应答者”也用了相同的方法确定。在选择的51个样本中，有5个被定义为“无应答者”，另外5个被定义为“应答者”。(图1.A)
表1. TCGA和CGGA数据集中患者的临床特征
图1.A 确定对RT和化疗有应答者和无应答者
2.Rscore特征和Cscore特征的建立和验证
在这一节，作者构建了Rscore和Cscore两个signature，分别代表对RT和化疗的耐受程度。由于RT和化疗的耐受机制具有相似之处，为了更好区分RT和化疗的不同受益者，因此需要避免Rscore和Cscore之间可能的强共线性。图1.A是构建Rscore(Cscore)的整个过程。作者首先使用R包“edgeR”，基于FC> 2和FDR <0.05确定了非应答者和应答者之间的差异表达基因(DEG)。构建Rscore时，通过R软件包“survival”，对tr-DFS进行单变量Cox回归分析，然后选择了放疗组P＜0.01和非放疗组P＞0.1的DEG交集进行下一步的LASSO回归。这一步取交集的原因是要避免非放疗因素对预后的影响。在LASSO回归中，图2.A左侧虚线上方对应的数字即表明最佳Penalty系数λ下纳入模型的有5个候选基因。最后对候选基因进行多元Cox回归分析(图2.C)，最后获得包含4个基因的Rscore。在构建Cscore时方法也是相同的，图2.B表明最佳λ下纳入模型的有13个候选基因，经多因素COX分析(图2.D)，最后得到包含6个基因的Cscore。根据风险模型的含义，两个分数越高，对相关治疗的耐受性越强。Rscore和Cscore的表达式如下：
接着作者测试了所有原发肿瘤中Rscore和Cscore之间的共线性，Pearson相关系数仅为0.25（P <.0001），说明可以将它们结合起来进行患者分层。
图1.B 基于LASSO的Cox模型的构建过程
图2.LASSO和Cox分析的结果
接下来，作者在训练集和验证集中验证了两个score区分tr-DFS和OS的能力。根据中位Rscore（Cscore）将患者分为低风险和高风险组，并选择接受相关疗法（RT或化学疗法）的患者进行生存分析。在TCGA（P = 3.621e−08，AUC = 0.84）和CGGA（P = 1.133e-03，AUC = 0.72）数据集中，高Rscore具有更差的预后(图3.A-D)。在TCGA（P = 7.965e−09，AUC = 0.79）和CGGA（P = 6.207e-03，AUC = 0.73）数据集中表明了高Cscore具有更差的预后(图3.E-H)。
图3.Rscore和Cscore的验证
为了验证预后模型的独立性，作者还纳入组织学分级，患者年龄，是否接受RT或化疗，Karnofsky行为评分，IDH状态，1p/19q 共丢失情况，MGMT和TERT启动子状态与Rscore或Cscore一起进行多因素COX回归分析，结果显示，Rscore（P = 0.03）和Cscore（P = 0.01）都是独立的预后因素。
补充图 S1.A-B Rscore和Cscore对预后影响的独立性的多因素COX回归验证
在这项研究之前，放射敏感性预测分析（RSI）分数被用于预测放射治疗敏感性，作者将该分数与Rscore进行比较。结果表明，RSI无法预测TCGA中接受了RT的患者的tr-DFS或OS(图S1.C-D)；在CGGA中，虽然可以预测接受了RT的患者的预后(图S1.E)，但AUC小于Rscore的AUC(图S1.F)，说明作者进一步改进了RT的预后模型，可以较好地区分出不同患者的预后。
补充图 S1.C-F Rscore和RSI在TCGA和CCGA中预测模型的比较
3.基于Rcore和Cscore的患者分层
根据Rcore和Cscore水平，作者将TCGA原发性LGG分为四组：RSCS（对RT敏感和对化疗敏感），RSCR（对RT敏感和对化疗耐受），RRCS（对RT耐受和对化疗敏感）和RRCR（对RT耐受和对化疗耐受）。表2显示了四组的临床资料。
尽管在上一节中已经验证了两个评分对预后的预测能力，但是还需要基于两个评分的组合来进一步验证分层的预测能力。作者从TCGA数据集中选择了194例同时接受了放疗和化疗的患者进行预后分析。结果显示，这4组的预后显著不同，RRCR组预后较其他组要差，RSCS组预后较其他组要好(图4)。在CGGA队列中也观察到了类似的结果。
表2.Rscore和Cscore定义的四组患者的临床特征
图4.在TCGA中验证了基于Rscore和Cscore的分层预测能力
4.RRCR组中较高的CD8 + T细胞和B细胞比例与治疗耐受相关
为了进一步研究RRCR组的耐受机制，作者对154例RRCR患者进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析了RRCR与其他组之间1047个DEG（FC大于2，FDR <0.01），确定了与Rscore（Pearson cor = 0.76，P = 5E‐27）和Cscore（Pearson cor = 0.39，P = 2E-06）相关性最高的蓝色module，该module包含180个基因(图5.A)。基因富集分析表明，该module中的hub基因（连接性最高的25％）与免疫应答，T细胞受体信号传导和B细胞谱系介导的免疫相关，说明RRCR组的免疫微环境与其他组存在差异。
为了确定RRCR与其他组之间的免疫细胞差异，作者使用MCP counter包检测了所有LGG样本，MCP counter包可从转录组数据中对不同样本中的八种免疫细胞和两种基质细胞的绝对丰度进行定量，这个R包的说明具体可以参考https://doi.org/10.1186/s13059-016-1070-5这篇文献。结果表明，与其他组相比，RRCR组有着更高的CD8+T细胞浸润和B谱系细胞比例(图5.B)。
作者还进一步发现了CD8+T细胞和B谱系细胞的比例与组织学分级，年龄和IDH状态有关。较高的CD8+T细胞比例与较高的组织学等级相关。在IDH野生型神经胶质瘤和40岁以上的患者中，CD8+T细胞和B谱系细胞的比例显著增加。(图5.C)
图5.RRCR组的免疫微环境
5.RRCR组比其他组更适合进行免疫检查点抑制剂治疗
由于RRCR组的CD8+T细胞浸润更高，所以作者进一步探索了这组患者是否比其他组更适合进行ICI治疗。已知肿瘤新表位负荷相关的生物标志物和肿瘤微环境中免疫炎症的生物标志物均可以预测ICI的疗效。前者包括微卫星不稳定性（MSI）和肿瘤突变负荷（TMB），而后者包括肿瘤炎症特征（TIS）和多种抑制性受体（IR）的表达，例如PD-L1和CTLA4。作者使用了VarScan(http://varscan.sourceforge.net/index.html)计算了TMB。对于TIS的计算，是先通过减去11个管家基因表达的log2（FPKM + 1）的算术平均值，将每个基因的log 2（FPKM + 1）归一化，再根据Expanded immune signature里面18个基因的标准化表达的加权总和计算可得TIS。与其他组相比，RRCR组中PD-L1和CTLA4的表达上调(图6.A-B)，这表明RRCR组的抗PD1和抗CTLA4治疗可能有效。RRCR组的TMB（P = 0.001）和TIS（P<0.0001）均显著高于其他组(图6. C-D)。以上结果表明，RRCR组的患者会更适合ICI治疗。
图6. RRCR与其他组之间PD‐L1，CTLA4表达以及TMB和TIS的比较
小结
本篇文章基于942个LGG样本数据开发了Rscore和Cscore预测放疗和化疗敏感性的两个signature，并构建和验证了基于Rscore和Cscore以及它们分层的预后模型，根据不同患者的分数可以为更精确的辅助放化疗提供指导。对于两种疗法均耐受的患者，作者发现了其耐受机制与肿瘤微环境中免疫细胞浸润有关，提出了除了传统的术后放疗和化疗外，还可以在RRCR组的治疗方案中增加ICI治疗的做法，当然这需要通过临床研究进一步验证。
作者在分析过程中做的比较好的地方是注意到了Rscore和Cscore可能的共线性，还考虑到其他混杂因素的影响，最后验证了Rscore和Cscore都是独立的预后因素。但仍存在一些局限性，尽管不同化疗药物的耐药机制是类似的，但Cscore作为一个通用的评估耐药性得分，当预测对特定药物的反应时可能准确性有所降低。