mRNA疫苗在传染性疾病中的研究进展
传染病疫苗是目前mRNA疗法最先进的应用。目前临床前试验和临床使用的大多数mRNA疫苗都采用注射到皮肤、肌肉或皮下的方式，在那里它们被免疫或非免疫细胞吸收并转化为抗原，呈递给T细胞和B细胞（图1）。mRNA和载体都能够增强mRNA疫苗的免疫原性和效力。
（1）注射的mRNA疫苗被抗原呈递细胞内吞。（2）在逃离内质体进入胞浆后，mRNA被核糖体翻译成蛋白质。翻译后的抗原蛋白可以通过多种方式刺激免疫系统。（3）胞内抗原被蛋白酶体复合物分解成更小的片段，这些片段通过主要组织相容性复合物（MHC）I类蛋白在细胞表面显示给细胞毒性T细胞。（4）活化的细胞毒性T细胞通过分泌细胞溶解分子（如穿孔素和颗粒酶）杀死感染细胞。（5）此外，分泌的抗原可被细胞吸收，在内体中降解，并通过MHC II类蛋白在细胞表面呈现给辅助性T细胞。（6）辅助性T细胞通过刺激B细胞产生中和抗体，以及通过炎性细胞因子激活巨噬细胞等吞噬细胞，促进清除循环病原体。
截至2019年底，已有15种针对传染病的候选mRNA疫苗进入临床试验，但没有一种进入第三阶段试验（表1），当时，人们认为mRNA疫苗至少还需要5-6年才能获得监管部门的批准。当2020年初COVID-19大流行席卷全球时，这些想法就被颠覆了，在接下来的几个月里，mRNA疫苗的研发、制造和部署都进入了终极考验的阶段。
表1 针对除COVID-19 以外传染病的 mRNA 疫苗的临床试验
介导进入细胞的表面蛋白通常被mRNA疫苗用于靶向病毒（图2），例如， SARS-CoV-2的棘突蛋白、流感病毒的血凝素蛋白、塞卡病毒的膜和包膜蛋白（prM-E）、呼吸道合胞病毒（RSV）与人类免疫缺陷病毒（HIV）、埃博拉病毒和狂犬病病毒表面糖蛋白的融合蛋白。此外，利用非表面抗原（如疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）或恶性疟原虫富含谷氨酸蛋白（PfGARP））可以靶向疟原虫等复杂病原体。每种病原体都具有一系列独特的挑战，包括高致死率、快速突变、免疫逃避、新菌株和变异等。根据不同的挑战，编码构象特异性蛋白质、抗原保守区或单克隆抗体的mRNA疫苗可以为健康成人、儿童、老年人和孕妇提供保护。VAED：疫苗相关强化疾病。
图2 在研的mRNA疫苗使用疾病特异性靶向策略保护一系列常见病原体
文末还有直播福利！
大多数SARS-CoV-2候选疫苗对病毒表面的棘突蛋白产生免疫反应。棘突蛋白与其宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2结合。然后，细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶2将附着的棘突蛋白切开，该蛋白酶诱导构象变化，暴露棘突蛋白的融合肽并促进与细胞或内体膜的融合。通常，疫苗mRNA编码的抗原要么是全长棘突蛋白，要么是棘突蛋白的受体结合域。
截至2021年6月18日，185个CVID-19疫苗候选处于临床前开发阶段，另外102个已进入临床试验。在临床试验中，19种为mRNA疫苗。2020年12月11日，辉瑞的BNT162b2疫苗获得了FDA的紧急授权，成为第一个获准用于人体的mRNA药物。一周后，Moderna疫苗mRNA-1273也被授权在美国使用。最终，它们是第一批在美国、英国、加拿大和其他几个国家获得授权的SARS-CoV-2疫苗。
辉瑞和BioNTech共同开发了五种mRNA候选疫苗，它们编码棘突蛋白抗原的变体。两个主要候选药物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可电离脂质ALC-0315和核苷修饰的mRNA，其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代，以增强mRNA翻译。BNT162b1编码三聚体分泌型棘突蛋白的受体结合域，而BNT162b2编码全长SARS-CoV-2棘突糖蛋白，S2亚基中有两个脯氨酸替换，将蛋白锁定在融合前构象。
在两种疫苗的第一阶段试验中，都可诱导高滴度的中和抗体，并产生强烈的CD4 和CD8 反应，伴有轻度至中度不良反应。两种候选疫苗耐受性良好且有效，但只有BNT162b2疫苗因其较轻的全身和局部不良反应而进入II/III期试验。在第三阶段试验中，BNT162B2显示了95%的整体预防和90～100%的疗效。
Moderna与国立卫生研究院合作开发了mRNA-1273。该疫苗使用了可电离脂质SM-102制备LNP，该LNP封装N1甲基假尿苷修饰的mRNA。该序列编码SARS-CoV-2棘突蛋白，带有两个脯氨酸替换，赋予融合前构象。
在1期临床试验中， mRNA-1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期试验中，两支100μg剂量疫苗的预防率为94.1%，注射部位的局部疼痛是最常见的副作用。第二次给药后，一半的志愿者报告了中度至重度系统性副作用（例如疲劳、肌肉疼痛、关节疼痛），这些副作用在48小时内消失。
尽管辉瑞和Moderna公司生产的疫苗已证明具有良好的疗效和安全性，但它们对冷链储存的需求带来了保障的巨大困难。mRNA-1273可在4-8℃下储存持续一个月，而BNT162b2则需要在-60℃条件下储存。
CureVac的候选疫苗CVnCoV在5℃下可稳定储存3个月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics（可能是ALC-0315）的可电离脂质和编码具有两个脯氨酸替代物的全长棘突蛋白的未修饰mRNA。在第一阶段临床试验中，志愿者产生的中和抗体与CVID-19恢复期患者相似，耐受性良好。然而不幸的是，在包括4万人的III期临床试验中，CVnCoV仅显示出47%的疗效。中期分析表明，CVnCoV的较低疗效归因于新出现的SARS-CoV-2变异。
目前，CureVac正与GSK合作，开发第二代候选药物——CV2CoV，该药物经过优化，以增强相对于CVnCoV的翻译和免疫原性。CV2CoV使用来自人类羟基类固醇17-β-脱氢酶4基因的5′UTR和来自人类蛋白酶体20S亚单位β3基因的3′UTR。在临床前研究中，CV2CoV在体外显示出比CVnCoV高1.8倍的蛋白表达，并在大鼠中诱导针对B.1.1.7、B.1.1.298和B.1.351变体的高滴度交叉中和抗体。
另一种耐热候选疫苗ARCoV由中国人民解放军军事科学院与Walvax生物技术公司合作开发，可以在25℃稳定一周。ARCoV编码棘突蛋白的受体结合域。在临床前研究中，在食蟹猴中可诱导高SARS-CoV-2特异性IgG抗体和强病毒中和滴度。尽管CVnCoV和ARCoV热稳定性背后的原因尚不清楚，但mRNA二级结构、较小的mRNA大小、GC含量和脂质可能是重要因素。
其它一些mRNA候选疫苗也正在研制中。LNP-nCoVsaRNA由伦敦帝国理工学院和Acuitas Therapeutics合作开发，编码全长棘突蛋白。目前，正在使用0.1–1µg剂量递增方案进行I期临床试验评估（ISRCTN17072692），其使用了所有候选mRNA疫苗中最低的RNA剂量。
另一种自扩增mRNA疫苗候选物ARCT-021（也称为LUNAR-COV19）由Arcturus公司利用其专有的LUNAR脂质载体和自转录和复制RNA（STARR）平台开发。它编码全长融合前棘突蛋白。
流感病毒
全世界每年约有29-65万人死于流感病毒。目前的疫苗多以促进病毒进入的病毒血凝素蛋白为靶标（图2），然而，该病毒突变迅速，导致抗原漂移，需要每年对疫苗的血凝素抗原成分进行审查和修改。传统的流感疫苗是生长在鸡胚中的灭活流感病毒，其生产时间长，纯化困难。此外，病毒会在鸡胚中发生变异，导致疫苗无效。例如，在2016-2017年期间，卵生疫苗中糖基化位点的缺失与疫苗的低效相关。体外转录的合成mRNA可以替代抗原靶标，并确保在出现全新流感菌株时快速生产疫苗。例如，2013年，基于LNP（DLinDMA）的自扩增mRNA疫苗在中国H7N9疫情爆发后8天内迅速研制成功。但不幸的是，由于当时没有用于mRNA制造的GMP设施，因此无法进行I期试验。
也有人致力于研制一种不需要每年修改的通用流感疫苗，这种疫苗可以对几种流感病毒株和亚型产生免疫力。2012年首次公示的流感mRNA疫苗数据表明，三次皮内注射80μg 来自PR8H1N1毒株的编码血凝素的RNActive-mRNA分别诱导了针对H1N1和H5N1毒株的同源和异源免疫，并保护了小鼠免受致死病毒剂量（10×LD50）的伤害。从那时起，针对基于mRNA的流感疫苗的几种递送载体（DLinDMA、DOTAP、聚乙烯亚胺和阳离子纳米乳剂）、替代mRNA技术（核苷修饰的mRNA和自扩增的mRNA）和替代抗原靶点进行了评估。
不易发生突变的血凝素保守区是一种新的通用疫苗靶点。编码Cal09 H1N1菌株的保守血凝素区域、基于基于LNP的mRNA疫苗在小鼠、雪貂和兔子中均产生特异性抗体反应，广泛的保护性抗体赋予小鼠对Cal09H1N1的同源免疫、对PR8 H1N1的异源免疫和对H5N1的异源亚型免疫，并保护它们免受致死毒力的攻击。另一项研究50 ng剂量的核苷修饰mRNA编码三种保守的流感蛋白：神经氨酸酶、核蛋白和基质-2离子通道蛋白以及血凝素柄（图2），这种微小的mRNA剂量竟出人意料地产生了广泛的保护性抗体，保护小鼠免受异常大的病毒攻击（500×LD50）。
在2016年的两个独立的I期试验中，Moderna评估了两种流感候选疫苗，这些疫苗通过两次肌肉注射LNP给药，LNP包裹了表达H10N8和H7N9全长血凝素的核苷修饰mRNA（表1）。结果表明，两者都能产生良好的血清转化和血清保护，且不良反应仅限于注射部位疼痛、发红、肌肉疼痛、关节疼痛、头痛、疲劳和寒战/普通感冒样症状，这表明疫苗具有良好的安全性和耐受性。
塞卡病毒
塞卡病毒感染于1947年首次被发现，感染塞卡病毒的患者通常无症状或出现发热、皮疹和肌肉疼痛等轻微症状。然而，塞卡病毒在2015-2016年美洲流行期间演变成为全球健康危机，该病毒可导致严重的胎儿神经畸形和怀孕期的胎儿死亡。幸运的是，所有塞卡病毒感染都是由单一血清型引起的，这表明接种任何菌株的抗原的疫苗都可以预防所有塞卡病毒。膜和包膜蛋白（prM-E）是针对塞卡病毒的mRNA疫苗的常见抗原选择（图2），因为针对prM-E的中和抗体可以防止病毒融合。
单次30μg或50μg剂量的LNP包装的核苷修饰的prM-EmRNA疫苗可产生的中和抗体滴度比纯化的灭活病毒和DNA疫苗在小鼠体内诱导的抗体效价高50-100倍，在恒河猴体内比1mgDNA疫苗产生的抗体效价高50倍。值得注意的是，设计不当的塞卡病毒疫苗会增加登革热病毒的传染性，登革热病毒与塞卡病毒属于同一家族，它们的包膜蛋白具有54-59% 的重叠氨基酸序列。因此，塞卡疫苗编码的包膜蛋白抗原可能刺激产生与登革热包膜蛋白交叉反应的抗体。在随后登革热病毒感染的情况下，可能会发生抗体依赖性增强反应，其中次优的塞卡抗体与登革热病毒结合。这种结合会促进病毒进入宿主细胞并加剧登革热症状。Moderna与华盛顿大学医学院合作提出了一种改良的prM-E mRNA，在E蛋白中包含突变的融合环表位。两个10 µg剂量的LNP包裹的修饰mRNA在相隔21天的时间内递送，可保护小鼠免受塞卡病毒攻击，并减少登革热增强抗体的产生。
另一项研究使用被动免疫方法，并使用角鲨烯基纳米载体递送编码中和ZIKV-117单克隆抗体（mAb）的mRNA，在病毒接种前一天或后一天注射一次40µg剂量，可保护免疫受损小鼠免受致死病毒攻击。使用类似的方法，Moderna在小鼠接种基孔肯雅病毒后4h成功地向小鼠递送编码单克隆抗体CHKV-24的mRNA，保护了小鼠免受基孔肯雅病毒诱导的关节炎。
这些结果表明编码中和单克隆抗体的mRNA疗法可能具有预防和治疗活性。此外，对于免疫系统受损而无法合成自身抗体的免疫缺陷患者来说，被动免疫是一种很有吸引力的方法。
HIV
艾滋病是由于感染艾滋病毒而导致的一种危及生命的慢性疾病，自1981年发现以来，尚未找到真正有效且负担得起的治疗方法，这主要是因为HIV包膜蛋白具有显著的抗原多样性和隐藏关键包膜蛋白表位的密集“聚糖屏蔽”。战胜艾滋病毒是研制mRNA疫苗的一个重要课题，目前，在临床研究中有几种用于治疗艾滋病的mRNA疫苗。DC递送系统的体外加载是通常用于癌症治疗的首选递送方法，在传染病中，它几乎完全用于艾滋病的治疗研究，并被广泛证明能安全地引起抗原特异性CD4 和CD8 T细胞免疫应答。然而，在2016年，Gandhi等人报告了一项利用转染了编码HIV-1结构蛋白Gag和Nef的mRNA的自体DC对HIV-1阳性参与者进行免疫的临床试验，结果令人失望。在该试验中，仅检测到短暂和微弱的免疫反应，表明DC疫苗接种有必要改进。因此，能够引发强烈抗原特异性T细胞免疫反应的传递系统在艾滋病治疗中越来越受到重视。
几项临床前研究使用多种载体（包括阳离子纳米乳剂、DOTAP/DOPE脂质体、聚合物和可电离LNP）递送了编码HIV蛋白质的mRNA疫苗，取得了不同程度的成功。这些研究表明，除了有效的载体外，还需要新的抗原来有效地靶向HIV。
HTI-TriMix 是激活佐剂 TriMix 和选定 mRNA 的组合，该 mRNA 包含来自 HIV-1 结构蛋白（Gag、Pol、Vif 和 Nef）的 16 个保守片段，是一种基于 mRNA 的针对 HIV-1 的新型治疗性候选疫苗，编码强激活信号和有效的 HIV 重组抗原，临床前结果表明了成熟 DCs的有效诱导、抗病毒细胞因子分泌（尤其是 IFN-γ）和 T 细胞刺激。结内注射 HTI-TriMix 的小鼠能够产生强效的抗原特异性细胞毒性 T 细胞反应。截至2019年底，HTI-TriMix已完成I期和IIa期临床试验。在 IIa 期，感染 HIV-1 的参与者在第 0、2 和 4 周接种了三针疫苗，这些疫苗通过腹股沟淋巴结超声引导给药检测。尽管 HTI-TriMix 显示出良好的安全性和耐受性，但不幸的是在 HTI 重组抗原编码序列上游发现了一个意想不到的起始密码子，可能对 HTI 蛋白表达产生负面影响。未来对校正 HTI 的研究尚不确定，考虑到 mRNA 疫苗的额外翻译过程，体外 mRNA 表达的预测试值得我们关注。
由于对艾滋病毒认识有限，发病机制尚不明确，艾滋病的治疗还存在诸多困难。未来 mRNA 疫苗设计应强调选择合适的抗原和递送系统，以引起强烈的抗原特异性 T 细胞免疫反应。此外，预防艾滋病的mRNA疫苗也可能是一个可行的策略。
呼吸道合胞病毒
呼吸道合胞病毒（RSV）是全球急性下呼吸道感染的主要原因，每年约有60000名5岁以下儿童、14000多名65岁以上的人死亡。由于诸多挑战，40年的疫苗开发尚未生产出经批准的RSV疫苗。1968年，福尔马林灭活RSV候选疫苗在儿童中引起了疫苗相关增强性疾病（VAED），这一反应导致肺部嗜酸性粒细胞和中性粒细胞过度浸润，导致80%接种疫苗的儿童出现严重的毛细支气管炎或肺炎，并导致两人死亡。
目前的RSV候选疫苗主要针对高度保守、有助于病毒融合的F蛋白（图2）。尽管由于中和抗体滴度不足，一些候选疫苗的临床试验失败，但对F蛋白构象的新发现表明，针对融合前构象接种疫苗可引发更好的中和抗体反应，这一发现有望改进未来的疫苗设计。mRNA疫苗可以通过设计编码序列来编码稳定的F蛋白构象。在临床前研究中，使用阳离子纳米乳剂和LNP成功递送了编码天然RSV F蛋白或稳定的融合前构象的mRNA疫苗，没有观察到任何VAED实例。
埃博拉病毒
埃博拉病毒（EBOV）于1976年首次被确定为导致埃博拉病零星爆发的病原体，这种病毒性出血热在50-90%的患者中是致命的，具体取决于病毒株；2014-2016年西非埃博拉疫情，夺走了11000多人的生命。2019年，FDA批准了一种基于重组水泡性口炎病毒（VSV）的埃博拉疫苗（rVSV-EBOV）。尽管与未接种疫苗相比，rVSV-EBOV在预防埃博拉传播方面的有效性为97.5%，但临床试验发现了一些安全问题（例如高剂量导致的急性关节炎和皮疹）。抗埃博病毒的mRNA疫苗可能比这种基于病毒的疫苗更安全，因为它们不会在体内复制。一种mRNA疫苗在小鼠中证明了利用聚氨基胺树状大分子纳米颗粒递送编码EBOV糖蛋白（图2）的未经修饰的自扩增mRNA的效力，该疫苗通过CD8 和CD4 T细胞诱导糖蛋白特异性IgG抗体和IFNγ以及IL-2的强烈表达，两种给药方案（两次4 μg剂量或一次40 μg剂量）均能保护小鼠免受致命攻击。另一项研究用两次20μg剂量的LNP封装、核苷修饰的编码EBOV糖蛋白的mRNA接种豚鼠，诱导了高抗体滴度，同时保护动物免受致命病毒攻击。
狂犬病病毒
狂犬病是一种人畜共患的病毒性疾病，以神经系统症状为特征，死亡率接近100%。尽管疫苗已获得批准，但每年仍有5万多人死于狂犬病，这突出了更有效、更廉价的疫苗的重要性。CureVac部署了其RNActive平台，以在候选狂犬病病毒CV7201中提供编码狂犬病病毒糖蛋白的未经修饰的mRNA（表1）。在一项临床前研究中，两剂间隔21天的80µg疫苗可诱导小鼠和猪产生高中和抗体滴度，并诱发抗原特异性CD4 和CD8 T细胞反应。给药途径不影响免疫反应，但给药装置会影响免疫反应，只有皮内注射器产生了短暂的体液反应，这种较弱的给药效果以及不良事件的高发生率表明需要进一步优化给药平台。随后，CureVac使用AcuitasTherapeutics生产的专有LNP作为其新的狂犬病候选药物CV7202的递送工具。在一项临床前研究中，CV7202提供编码狂犬病病毒糖蛋白的未经修饰的mRNA，并产生强抗体和CD8 和CD4 T细胞反应。在非人类灵长类动物中，间隔28天的两次100µg剂量的疫苗耐受性良好，其抗体滴度比商业许可的狂犬病疫苗高20倍。I期临床结果表明，两次1µg剂量可产生高中和滴度、强适应性免疫反应，并且耐受性良好。
巨细胞病毒
编码巨细胞病毒（CMV）糖蛋白gB和五聚体复合物（PC）的改良mRNA/LNP疫苗的不同组合在小鼠和食蟹猴体内诱导了有效的中和抗体滴度，并且在222天的研究期间，在1、2或3次剂量后，滴度保持良好。在小鼠和猕猴中测得的中和抗体水平与服用人体剂量的Cytogam（临床上用于CMV预防的IgG制剂）后达到的水平以及CMV 人类供体血清中测得的水平进行基准测试，与这些对照组相比，接种疫苗后观察到更高或相似的抗体滴度和中和作用。
另一种基于自复制RNA（表达hCMV pp65-IE1）的CMV疫苗（用阳离子纳米乳剂（CNE）配制）也在恒河猴体内诱导中和抗体和CD4 T细胞反应。用已在人体试验过的mRNA技术预防人类CMV疾病的另一种方法是，在体外使用电穿孔将编码CMV pp65的mRNA 进行自体DC给药，这会导致pp65特异性T细胞反应的诱导或扩增。这种方法也在对HIV-1感染者的多个临床研究中得到了验证，通过给自体DC电穿孔的mRNA编码各种HIV-1抗原来增强HIV-1特异性T细胞免疫。
细菌和寄生虫
除病毒靶标外，自扩增mRNA疫苗已被证明可诱导针对细菌病原体的免疫反应，并在小鼠攻击模型中通过被动和主动免疫提供部分保护。疫苗接种后，保护作用也能转移到新生儿身上，这表明自扩增mRNA疫苗也可能适用于母体免疫方法。
疟疾是由疟原虫属的单细胞真核寄生虫引起的，其发病率和杀伤力位居榜首。由于缺乏表面抗原和疟原虫的复杂生命周期，抗疟疫苗的生产一直很困难，但对人体对疟原虫感染的自然免疫反应的研究已经确定了潜在的非表面抗原靶点。
例如，疟原虫分泌的细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）已被证明可以阻止T细胞发展长期记忆。根据这一发现，基于角鲨烯基阳离子纳米乳剂制备了一种疫苗，该纳米乳剂装载有编码PMIF的自扩增mRNA。两次15µg剂量改善了辅助性T细胞的发育，并诱发了抗疟原虫IgG抗体和记忆性T细胞反应。此外，过继转移接种小鼠的T细胞可以保护未接种小鼠免受疟原虫子孢子的感染。另一项关于疟疾感染的机制研究发现，恶性疟原虫富含谷氨酸的蛋白（PfGARP）是一种潜在的mRNA疫苗靶点。
2017年，Maruggi等人设计了两种预防性SAM疫苗，分别与编码来自A组（GAS）链球菌的链球菌溶血素-O（SLOdm）和来自B组（GBS）链球菌的菌毛2a骨干蛋白（BP-2a）的CNE混合。接种的小鼠成功地产生了大量功能齐全的抗体，这些抗体可通过增强剂显著增加，并且提高了GAS和GBS感染的存活率。
参考文献
1. Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. mRNAvaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinicaltranslation. Nat Rev Drug Discov. 2021 Aug 25:1–22. doi:10.1038/s41573-021-00283-5. Epub ahead of print. PMID: 34433919; PMCID:PMC8386155.
2.MaruggiG, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a Transformative Technology forVaccine Development to Control Infectious Diseases. Mol Ther. 2019 Apr10;27(4):757-772. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.01.020. Epub 2019 Feb 7. PMID:30803823; PMCID: PMC6453507.
3.XuS, Yang K, Li R, Zhang L. mRNA Vaccine Era-Mechanisms, Drug Platform andClinical Prospection. Int J Mol Sci. 2020 Sep 9;21(18):6582. doi:10.3390/ijms21186582. PMID: 32916818; PMCID: PMC7554980.
4.CagigiA, Loré K. Immune Responses Induced by mRNA Vaccination in Mice, Monkeys andHumans. Vaccines (Basel). 2021 Jan 18;9(1):61. doi: 10.3390/vaccines9010061.PMID: 33477534; PMCID: PMC7831080.