细胞凋亡流式检测步骤

原理:Annexin V 属于 Ca2+ 结合蛋白家族,可与磷脂(PL)发生可逆的Ca2+ 依赖性结合。在健康细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)主要位于质膜的胞质侧,当细胞凋亡开始时,PS 从质膜内部转移至外部,而 Annexin V 对 PS 具有高亲和力,可与暴露在外部细胞环境的 PS 结合。7-AAD(7-氨基-放线菌素D)具有高 DNA 结合常数,并且被完整细胞有效排除,可以排除无活力的细胞。在早期细胞凋亡中,PS 暴露于细胞表面,但质膜不包括 7-AAD。这些细胞用 Annexin V 染色,从而区分早期细胞凋亡中的细胞(Annexin V 阳性,7-AAD 阴性)。在晚期细胞凋亡中,细胞膜丧失完整性,从而允许 7-AAD 进入并与 DNA 结合,同时允许 Annexin V 与细胞膜上的 PS 结合(Annexin V 阳性,7-AAD 阳性) 。然而,该测定法不能区分经历凋亡的细胞和由于坏死而死亡的细胞,在任一情况下,死细胞都会被 Annexin V 和 7-AAD 染色。

实验步骤:

1.制备阳性细胞:选择1盘10cm皿细胞,打开培养皿盖子,放置于紫外灯下照射2小时。或使用碧云天细胞凋亡阳性对照试剂盒提前处理阳性细胞。

2.收集细胞:将待测细胞(包括阴性与阳性对照细胞)的上清分别收集至15mlEP中,使用2mlPBS冲洗细胞,加入1ml不含有EDTA的胰酶,至37°培养箱中消化,至细胞大片脱离皿底。用刚才收集的上清液终止消化后,转移至刚才的15mlEP管中。2000rpm,室温,离心5min,弃上清。

3.清洗细胞:用1ml常温1*PBS重悬细胞,转移至1.5mlEP管中。2000rpm,室温,离心5min,弃上清。

4.细胞计数:使用细胞计数仪进行细胞计数,每组取2*106细胞。

5.染色:使用200ul缓冲液重悬细胞(2*106),所有实验组与阴性对照需要双染,阳性对照需要设置两个染料的单染管。双染管加入5ul Annexin V染料,5ul7-AAD,单染管加入单独的5ul Annexin V染料或5ul7-AAD,标清楚单染染料名称。用手弹匀,避光染色15min。(染色过程中准备流式管和滤膜。打开流式细胞仪,检查鞘液和废液情况)

6.染色完毕后,加入1mlPBS,2000rpm,室温,离心5min,弃上清。再加入100ulPBS重悬,过200目滤网。

7.上机设置:打开SSC,FSC,BB515下的FITC通道,以及7-AAD通道,其他用不到的通道删除。使用log模式,全选A,H,W指标。设置初始读值:一般癌细胞SSC设置180-200,FSC设置180-200,FITC电压值设为280左右,7-AAD设置350左右。右侧设置如下:

上机顺序,1-阳性Annexin V单染管,2-阳性7AAD单染管,3-阴性,4-实验对照,5-实验组……

8.电压及补偿调节:看各自通道的峰图调节电压,使阴性峰的峰尾在102和103之间,峰靠右则降低电压,峰靠左则升高电压。上Annexin V单染管时,调节7AAD-FITC补偿,输入X%,使十字门一二象限没有细胞信号。上7AAD单染管时,调FITC-7AAD补偿,输入X%,使十字门一四象限没有细胞信号。若实验时间有限,来不及调节好补偿。FITC-7AAD和7AAD-FITC都输入1%,以保留补偿门,可在FlowJ软件上再次调节。

9.电压和补偿调节好后,不可再次改变。若电压发生改变,补偿应该再次调节。每管细胞收30000-50000个。

10.按照清洗流程标准清洗流式细胞仪,拷贝数据。

11.FlowJ调节补偿,打开FlowJ的界面,把两个单染管拖入补偿组。自动调节补偿后应用至所有实验组。

根据阴性对照设置十字门,保证一二四三个象限中细胞数小于0.4%。应用阴性对照圈门至所有实验组。输出各组十字门结果至Layouts,合理排列后,调节字体大小与格式,Tiff格式输出。

【整理】刘桐凤

(0)

相关推荐

  • 细胞凋亡实验原理及步骤

    细胞凋亡或称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death ,PCD)是细胞的生命现象之一,它在机体的胚胎发育.组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用.细胞凋亡调节的 ...

  • 细胞系建好了,表型实验实验怎么做?

    我相信,同为科研沦落人的你,一定知道只要做了基因编辑细胞株的构建,无论是细胞敲除.敲入,还是点突变.稳转株,都难以逃脱要检测细胞表型的命运.毕竟你构建的细胞系连想要的表型都没有,是很难有底气投高分文章 ...

  • Annexin V-PI检测细胞凋亡的试剂

    Annexin V-PI检测细胞凋亡的试剂 Annexin V-PI 双染法 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生.破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜.该过程发生 ...

  • 流式细胞仪荧光补偿调节方法

    荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程.自单激光双色分析出现后,此过程变得十分重要.每种荧光素分子都具有自身的光谱发射范围.这些发射光谱之间存在相互叠加,在某些情况下此现 ...

  • 细胞凋亡的概念

    细胞凋亡是多基因严格控制的过程,这些基因在种属之间非常保守,如Bcl-2家族.Caspase家族.抑癌基因P53等.凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系,如肿瘤和自身免疫性疾病等,因此 ...

  • 讲堂精粹 | Annexin V凋亡检测实验详解

    细胞凋亡(Apoptosis)又称细胞程序性死亡(Programmed cell death),是一种为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的主动的死亡.凋亡的紊乱与肿瘤.自身免疫性疾病的发生具 ...

  • 流式检测细胞凋亡实验方法

    流式检测细胞凋亡实验方法

  • 实验时间|如何用流式检测细胞凋亡?

    前言 细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡,是由基因控制的主动性细胞死亡过程.越来越多数据发现,细胞凋亡与多种疾病密切相关,如癌细胞具有连续增殖.抵抗细胞凋亡能力,利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断,疗 ...

  • 流式检测胞内抗原时打孔液的配方?

    打孔液有很多种,方法也有很多.与你的实验方法相关.我用过酒精固定或Triton X-100(我做的都是培养的细胞): (1)70%的酒精固定24小时即可,不再需要再打孔.如在PI染色测细胞周期或凋亡. ...

  • 流式检测细胞周期凋亡是什么?

    流式细胞技术是利用流式细胞仪(flow cytomerty,FCM)进行的一种单细胞定量分析和分选技术.流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中的分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池,同时由荧光探测 ...

  • 流式检测ST段抬高型心肌梗死患者循环EVs的变化和远端缺血性调节的潜在影响(内含赠书福利)

    文末有<临床流式细胞学-检验技术>书籍赠送! 在过去的几十年中,临床实践的进步已使ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者的死亡率大幅下降.一个主要的贡献是及时地恢复了冠状动脉的血流,这是当 ...

  • 流式细胞凋亡检测实验常见问题详解

    流式细胞凋亡检测实验常见问题详解

  • 【技术干货】流式细胞凋亡检测--疑难解答

    【技术干货】流式细胞凋亡检测--疑难解答

  • 实验专栏丨一文读懂流式细胞凋亡检测

    Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一.它是一种磷脂结合蛋白,可以与早期凋亡细胞的胞膜结合,而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一. 由于在发生凋亡时,磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞 ...

  • 流式荧光染色法实验原理及步骤

    原理: 荧光染料CFSE, 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂,是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,这使得CFSE成为一种良 ...