揭开“封闭抗体和免疫治疗”的神秘面纱
近日常有患者于网上咨询，当出现反复移植失败时为什么要进行封闭抗体检查，主动免疫治疗对移植失败及复发性流产到底有什么作用，以及很多患者反映看不懂封闭抗体报告单，那今天生殖小青年，就对很多患者提出的问题进行一一解答！
简介解释一下复发性流产和反复种植失败在临床上的界定
复发性自然流产（RSA）是指临床上连续2次或2次以上的自然流产（包括：多次生化妊娠、空孕囊、无胎心、胎心消失等），是一种常见的妊娠并发症，发生率占妊娠总数的0.4%～0.8%。RSA 中约有40%～80%临床上找不到明确病因，称为不明原因反复自然流产。
反复种植失败的定义并没有统一的标准，大家比较认同的定义为：重复IVF治疗超过 3个移植周期；或者累计移植≥10个高评分胚胎未能怀孕者；或者各中心自定义移植胚胎数目。由于近年来单胚胎移植和囊胚培养技术普及，过去的标准显然不适用了，因此有人提出以胚胎计算的标准，如累计移植4枚高评分胚胎，或2枚囊胚仍然不能怀孕者。
同种免疫复发性流产是一种排他性诊断，医学上没有特异性的检测指标。对于2次或2次以上的自然流产患者，封闭抗体检查阴性，必须排除染色体异常、生死道解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染、免疫异常及血栓前状态等原因，并且排除了患者身体因素、心理因素、环境因素和男方因素后，可诊断为同种免疫型复发性流产。
什么叫主动免疫缺陷，它和复性流产有什么关系？
主动免疫缺陷：这类患者的体内不能产生保护胚胎的主动免疫抗体，对胚胎产生了免疫攻击，就是我们常说的“封闭抗体”缺乏，可以通过丈夫淋巴细胞的注射，诱导自身的主动免疫功能。但是目前我们采用的流式细胞仪的检测方法，并不能真正反映自体的主动免疫状态，因此治疗存在一定的盲目性。
治疗特点：作用效果慢，维持时间长，缺乏特异性的指标来监测治疗效果。
治疗缺点：不适合怀孕后免疫出现异常患者的及时治疗，因为作用效果慢，等起作用时，血b-HCG早就玩完了。
主动免疫治疗的简单发展历程
1981年，来自英国的Taylor和 美国的Beer 等创立了反复流产的主动免疫疗法，首次采用淋巴细胞人为的强化妊娠的免疫学维持机制，成功治愈原因不明性习惯性流产患者，开辟了反复流产治疗的新途径。此后，国内专家林其德等（1996 年）也将主动免疫疗法成功的应用于反复流产患者的治疗。
如何解读封闭抗体报告单
封闭抗体是妊娠时母体的一种胚胎保护性抗体，可以防止胚胎滋养层的父系抗体被母体免疫系统识别和攻击，使胚胎得到保护并生长发育。母体缺乏封闭抗体可能对胚胎儿产生排斥反应，孕早期出现流产，孕晚期出现妊娠高血压综合征、胎儿宫内生长迟缓、甚至胎死宫内。
按理论来说，正常妊娠的女性体内应该可以检测出“封闭抗体”，在同种免疫型复发性自然流产女性中，通常缺乏此种抗体。“封闭抗体”缺乏而导致的一系列反应是免疫系统淋巴细胞比例和功能的改变，如：具有细胞毒性的T细胞增多、具有免疫抑制功能的T细胞减少、自然杀伤细胞数量和毒性的增加等，胚胎和胎盘等成为免疫细胞攻击的靶点，胎盘血管生成出现障碍。由于“封闭抗体”有很多种，至少包括：抗HLA-D/DR抗体、抗丈夫淋巴细胞毒抗体(APCA)、抗TLX抗体(滋养层及淋巴细胞交叉反应抗体，Ab1)、抗独特型抗体（Ab2）、混合淋巴细胞反应封闭抗体(MLR-Bf)、抗Fc受体抗体等等，一般通过细胞毒性试验或夫妇间的淋巴细胞混合培养反应来检测，目前很多实验室只测其中某一个指标来下诊断结论,往往不是很全面，所以很多人查不出“封闭抗体”是阳性。
由于目前多采用流式细胞术对T淋巴细胞及其亚群检测来间接分析封闭抗体，所以我在这里主要对T淋巴细胞检测进行详细解说。在正常妊娠早期，CD8+细胞数量增多，CD4+/CD8+比值的降低，有利于胚胎免遭母体免疫系统的排斥，因为CD8+细胞在机体的免疫反应中发挥负调节作用，即可抑制B细胞介导的体液免疫，又可抑制CD4+细胞介导的迟发型超敏反应和增殖反应，还可对自然杀伤细胞及巨噬细胞的杀伤功能产生调控作用。在研究报导，RSA患者外周血中CD8+细胞百分率显著下降，CD4+/CD8+比值明显升高，有效治疗后可逆转。因此动态了解T淋巴细胞及亚九群的变化，对疾病的判断具有重要意义。
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分类 |
细胞表型 |
项目名称 |
参考值 不值实验室有不同参考值 |
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对照值 直接检测 男性全血T亚群 |
CD3+ |
T |
60-80% |
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CD3+ CD4+ |
Th |
30.09-40.4% |
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CD3+ CD8+ |
Ts |
20.74-29.4% |
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测定值 男性全血添加女性 血清后检测T亚群 |
CD3+ |
T-2 |
60-80% |
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CD3+ CD4+ |
Th-2 |
30.09-40.4% |
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CD3+ CD8+ |
Ts-2 |
20.74-40.4% |
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封闭效率 对照值—测定值 |
CD3-BE |
T细胞封闭效率 |
>0 |
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CD4-BE |
Th细胞封闭效率 |
>0 |
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CD8-BE |
Ts细胞封闭效率 |
>0 |
T细胞亚群检测流程（1）将流式管做好标记；（2）将7-10微升（CD4 FITC/CD8PE/CD3 PerCP）加入流式管底部；（3）每管加50微升抗凝血样标本，轻轻混匀，室温避光孵育15min；（4）加入500微升BDFACS lysing solution 轻轻混匀，室温（20-25℃）避光孵育15min；（5）加入2ml PBS，混匀，1200rpm离心5min，去上清；（6）350微升PBS重悬，流式细胞仪上机检测。
封闭抗体结果分析对照组：直接检测男性全血T亚群；测定组：向男性全血加女性血清后再检测T亚群；封闭效率：即直接检测男性全血的结果减去对应加了女性血清的结果所得的差值，其正常值>0。
主动免疫治疗流程
主动免疫的整个流程并不复杂，对于实验操作人员来讲，就是离心离心再离心，事个过程就是离心等时间的过程，所以敬请各位患者朋友在实验室外等候时不要焦虑，从整个流程下来来看，每个患者一般从采完血到注射完大约需要1.5个小时，请大家一定要进行耐心等待。
（1）免疫原可为丈夫或第三方的淋巴细胞，皮内注射。供受者双方无血缘关系。供受者双方均需筛查输血前全套，肝炎系列、HIV、梅毒等均无异常方可进行此项治疗，孕前开始治疗；（2）采集供血者静脉血肝素搞凝静脉血25ml，去掉注射针头，缓慢加入事先准备好的加有10ml生理盐水的无菌培养瓶内，轻轻混匀，将培养瓶放入超净工作台内，室温静置15min；（3）用巴斯德管将生理盐水稀释后的35ml肝素化血液分别加入事先准备好的3支各加有4ml淋巴细胞分离液的无菌离心管中，操作时注意将血液沿管壁慢慢加入，使分离液与血液形成整齐的液面；（4）将离心管放入自动平衡离心机内，以2500rpm室温离心20min，小心取出离心管，在超净工作台内，将上层血浆吸出，弃掉；（5）小心吸取中间液面上白色雾状的单核细胞，转入2支新的离心管，加入生理盐水，轻轻吹打混匀，以2300rpm室温离心10min，弃上清，加入适量生理盐水，轻轻吹打混匀，将2支离心管内的细胞并入1支离心管内，以2000rpm室温离心8min，弃上清，加入1.2ml生理盐水，混匀，细胞浓度约为（20-40）×106/ml；（6）将所得的淋巴细胞悬液，于患者前臂分6处作皮内注射，每处200微升（注：由于1ml皮试注射器推注时压力较大，须用手将注射针脱开，造成淋巴细胞液喷出浪费）。
不同实验室疗程次数不同
林其德（上海仁济医院妇产科）：每次注射淋巴细胞总数为（20-40）×106/ml，每次疗程免疫次数为2次，疗程间隔3周。第一疗程结束后，鼓励患者3个月内妊娠，如获妊娠则再进行1疗程。如3个月后仍未妊娠，则在排除不孕症的情况下重新进行1个疗程。（注：虽然免疫次数减少，但取得疗效相同）
李大金（上海市红房子妇道科医院）：抽取供血者50ml新鲜血，分离淋巴细胞（20-30）×106/ml，间隔4周1次，3次为1个免疫疗程。末次免疫后2周复查封闭抗体，如未升高，加强免疫1次，直至产生较高封闭抗体。
张建平（孙逸仙纪念医院妇产科）：孕前进行4次主动免疫，每次间隔4周。治疗结束后半个月复查封闭抗体，如封闭抗体转阳性或弱阳性，指导其受孕，于孕后再进行3次主动免疫，每次间隔4周。如复查封闭抗体为阴性，暂时不宜受孕，加4次主动免疫，治疗结束后半月第2次复查封闭抗体，如封闭抗体转阳性或弱阳性，指导其受孕。若第2次复查封闭抗体仍为阴性，则在指导受孕同时使用丙种球蛋白。