Vero细胞基因编辑案例

1.CRISPR/Cas9 系统助力猪流行性腹泻病毒入侵和感染Vero细胞的研究

猪流行腹泻病毒(PEDV)是一种阳性单链病毒，属冠状病毒亚科的单链病毒属。氨肽酶N（APN或CD13）是一种Ⅱ型锌金属蛋白酶，可以介导多种细胞生理过程，包括抗原提呈、细胞分化、细胞运动和冠状病毒进入。由于猪APN（pAPN）是猪肠道致病α冠状病毒（TGEV）的主要受体，Ji, Chun-Miao等人通过基因敲除Vero细胞系中 hAPN 或 pAPN 的内源性表达，发现 hAPN 和 pAPN 都不是 PEDV 的功能受体。为了完全排除可能低于检测限的 Vero 细胞中有潜在的 vAPN 产生，他们使用 CRISPR/Cas9 系统生成 vAPN 敲除细胞，即利用两个 gRNA/Cas9 复合物靶向 vAPN-CDS1，删除翻译起始位点下游 290-449核苷酸之间的 160 bp 片段（图2），并通过 IFA确认了这些敲除细胞 Vero-vAPNKO1和 Vero-vAPNKO2缺乏vAPN 的表达（图 3A）。研究结果显示在 PEDV-GFP 感染后，Vero-vAPNKO1和 Vero-vAPNKO2细胞都表现出与正常 Vero 细胞相似的CPE 和 GFP 的表达，这表明 vAPN 敲除对 PEDV 进入和感染没有影响^[5]。

图2 通过 CRISPR/Cas9 在Vero 细胞中敲除vAPN 基因

图3 时间分辨免疫荧光

2.基因敲除Vero细胞可以帮助增强型RV疫苗底物的开发

轮状病毒（RV）是全球范围内引起严重胃肠炎的主要原因，Nichole等人使用siRNAs筛选对RV复制产生负面影响的宿主基因，然后通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除选定的基因。与野生型Vero细胞相比，完全测序的基因敲除Vero细胞底物可增加RV复制和RV疫苗抗原表达。结果表明，与其他受试Vero细胞底物相比，EMX2基因缺失的Vero细胞的RV复制和抗原产生更高。基因敲除Vero细胞可以促进增强型RV疫苗底物的开发，并为改进RV疫苗生产提供了帮助。

图4

3.使用CRISPR/Cas9 系统在Vero细胞中敲入HSV病毒 DNA 基因组

细菌人工染色体（BACs）是控制DNA病毒（如疱疹病毒）大基因组的有力工具。因为这些DNA病毒（疱疹病毒）的基因组太大，无法克隆到质粒中。例如疱疹病毒 (HSV)，一种常见的 DNA 病毒，基因组长度为 152 kbp，可能会引起唇炎、生殖器疱疹和脑炎。但突变型 HSV 是肿瘤疗法的候选者，可以用于杀死肿瘤细胞。Suenaga等人使用CRISPR/Cas9 系统和Vero细胞作为基质研究突变型HSV，这种方法无需将人工基因插入病毒基因组中，就能实现HSV的基因敲降与基因敲入，还提高了预期突变病毒克隆的分离效率。此外CRISPR/Cas9 系统也可以应用于其他 DNA 病毒，如 Epstein-Barr 病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒和杆状病毒，对于研究各种类型的病毒，包括临床分离细胞株具有十分重要的作用^[6]。

图5 使用 CRISPR/Cas9 系统将基因特异性突变引入HSV-1 基因组