净水技术|原水输送管道中微生物群落结构竟然与管材有关！
《净水技术》
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陈桃源，周正协，陈 卫，林晨烁，王月婷，许 航
（河海大学环境学院，江苏南京 210098）
原水输送管道是城市给水系统重要的组成部分，原水管道潮湿的内壁给原水中污染物和细菌的附着提供了适宜的条件，并逐渐形成天然生物膜。已有研究表明在供水管道中，生物膜在管壁和水体界面间的物理、化学、生物反应中起很大作用，对水体中含氮污染物的转化产生重要影响。现有针对供水管道中生物膜结构及沿程变化的研究已较为完善，对探究原水管道内生物膜对含氮污染物转化的作用具有一定借鉴价值。而原水输送过程中含氮污染物间的相互转化直接关系到水处理技术效能及其水质安全，但限于实地研究的难度，现针对原水管道的研究甚少，仅有的只揭示进出水中氮转化规律或微生物群落结构及其多样性，并未深入阐明含氮污染物转化的机理及其同微生物之间的关联。
管材对管壁生物膜的形成有显著影响。当管材的粗糙度不同，微生物在管壁的附着度有所不同。管壁微生物进而会影响管道中含氮污染物的转化，因此管材对原水输送管道中含氮污染物转化的影响值得研究，而现有的相关研究缺失，鉴于此本研究利用原水输送管道模拟系统，根据对太湖流域原水管道管材使用的实际调研，选择应用最广的油漆内衬钢管和水泥内衬钢管为研究对象，对试验装置内的生物膜进行自然培养，考察相同水质下成熟生物膜中生物量和微生物群落结构的区别，并探究不同管材下，原水输送管道内生物膜微生物对含氮污染物转化规律的影响，为原水输送过程中及给水系统中含氮污染物的转化提供重要的理论依据。
1
试验材料和方法
1.1
试验模拟系统
本研究设计原水输水管道模拟装置（图1）。装置由三个水平放置的同心圆柱体管道构成，外管的管材为透明的有机玻璃，内管和中间管道管材相同，视实际原水输送管道的管材而定，本试验中一套装置的内管和中间管道采用油漆内衬钢管另一套装置为水泥内衬钢管。该装置的其他组成包括：驱动轴、发动机、推流器、毕托管、数显压差计、进水口、出水口、电磁阀、时控开关、原水箱、出水箱、潜水泵。
该原水输水管道模拟装置24 h不断循环，采用正态水力模拟系统，每隔6 h进水、出水（模拟实际管径为1 800 mm，流速为1.4 m/s，水力停留时间为6 h的管道）。该装置的左右侧外盖可拆卸，以方便生物膜取样。
图1 原水输送管道模拟装置示意图
1.2
试验装置管道管材、进水水质及分析方法
1.2.1
试验装置进出水水质及测定方法
生物膜自然培养及成熟期间，模拟管道装置进水采用XJ水源水，各水质指标见表1（2016年7月~2016年9月），其中溶解氧（DO）、总氮（TN）、氨氮（NH4+-N）、亚硝酸盐氮（NO2--N）、硝酸盐氮（NO3--N）、pH值、CODMn、浊度等水质指标均参考《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750—2006)和《水与废水监测分析方法》(第四版)的相关分析方法。
表1 试验原水水质
1.2.2
DON 分子量分布及亲疏水性测定
采用超滤膜法对进出水中DON分子量分布测定。在超滤杯中，放置以高纯氮气为压力驱动（压力约为0.15 Mpa）的磁力搅拌器；采用截留的分子量分别为10、5、3、1 KDa的超滤膜（美国 Milipore公司），其有效面积均为31.75 cm2。待测水样首先通过0.45 μm的微滤膜去除悬浮物质，后将水样依次通过不同截留分子量的超滤膜，从而测定过膜后水样中的DON含量，各级相减得到各分子量范围内DON含量。各范围内DON的半分比计算公式如下：
采用树脂吸附法测定DON的亲疏水性。试验前将待测水样通过0.45 μm的微滤膜进以去除悬浮物质，调节pH值为2后将水样依次通过Supelite DAX-8和Amberlite XAD-4树脂，从而将待测水样中的DON分离成疏水性、亲水性和中性成分三类具体操作步骤如图2所示。
1.2.3
试验装置管道管材粗糙度及测定方法
两种试验管材的表面绝对粗糙度如表2所示。
表2 两种试验管材的表面绝对粗糙度
1.2.4
微生物指标测定
管壁生物膜中的微生物群落结构组成由宏基因组测序来测定，采用OMEGA基因组提取试剂盒(D5626-01 E.Z.N.A.Soil DNA Kit)对生物膜样品进行总DNA提取与纯化。利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对提取到的DNA精确定量。参考了Miseq测序平台的V3-V4区的通用引物后，PCR引物序列设计为341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA CHVGGGTATCTAATCC。
第一轮PCR 扩增反应条件为94 ℃运行3 min；5个循环：94℃ 30s，45℃ 20 s，65℃ 30 s；20个循环：94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s；72 ℃运行5 min。10 ℃保存后进行第二轮PCR扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物反应条件：95 ℃ 30 s；5 个循环：95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s；72℃ 5 min。10 ℃保存。完成扩增后，利用琼脂糖电泳技术对PCR产物进行分析后用Qubit 2.0 DNA回收DNA。基因组测序采用Illumina MiSeq测序平台。首先利用barcode区分样品序列，将测序得到的结果行处理，随后对区分后的样品序列进行质量检测(QC)，以达到去除非靶区域序列与嵌合体的目的；接着根据序列间的距离对样品序列展开聚类分析，序列间的相似性作为域值分成操作分类单元的依据；然后利用RDP classifier基于Bergey's taxonomy（Bergey's taxonomy分为6层，它们依次为域、门、纲、目、科、属。），采用Naïve Bayesian assignment算法对每条序列在属水平上计算其分配到各层中的概率值，一般概率值＞0.8，说明此分类结果可信；从而得到各水平上的物种丰度，并计算序列丰度同时建立样本和物种分类单元序列丰度矩阵；最后基于OTU聚类和RDP分类结果，从序列样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建稀释曲线，使用97%相似度的OTU，利用mothur做rarefaction分析，利用R语言工具制作曲线图。原水和生物膜中的细菌总数由异养菌平板计数（HPC）测定。
利用CANOCO 5.0 (Microcomputer Power，Ithaca，NY，USA)进行冗余分析。冗余分析是一种约束排序线性模型分析，基于PCA排序过程加入环境因子进行线性回归，最终实现将多维数据样本（如种群、环境因子）尽可能多地排列在可视化低维空间内，使前几个排序轴囊括绝大多数的样本信息，用于检测环境因子与不同分类水平微生物群落丰度之间的相关性。进行排序分析之前，首先要判断是选择线性模型，还是单峰模型的排序方法，利用97%相似性的样品OTU表做除趋势对应分析（DCA）。具体步骤为：若一组种类（m个）有n个样方x，首先任意选择样方排序初始值yi，求种类的排序值Zi (i=1,2,3,…,m)，其数值为样方初始值的加权平均，如式（4）。
计算样方排序新值Zi (i=1,2,3,…,n)，再判定若最大排序轴梯度长度（LAG）超过4.0，则选典型对应分析CCA更合适，当3<LGA<4 时，线性与非线性模型均适合；LGA＜3.0时，选RDA结果较好。
2
结果和讨论
2.1
生物膜中的生物量比较
将运行一年的油漆内衬和水泥内衬旧管，反复冲洗至内外表面无生物膜后，重新运行，对不同管材不同粗糙度管内壁生物膜中HPC的数量进行检测，模拟管道中管壁生物膜生长状态和成熟状态下的HPC数量变化，如图3所示。
由图3可知，不同管材不同粗糙度的模拟管道生物膜中HPC的生长趋势一致，装置内生物膜中微生物的生长同样经历了适应期、对数生长期、脱落期和稳定期这四个阶段。然而HPC的数量存在数量级的差异。新旧管道模拟装置内生物膜中的HPC数量均在装置开始运行的第50 d左右时达最大值，其中油漆内衬旧管中HPC的最大值达到9.40×106 CFU/cm2，油漆内衬新管中HPC最大值达到4.53×106 CFU/cm2，水泥内衬旧管中HPC的最大值达到7.48×105 CFU/cm2，水泥内衬新管的HPC最大值达到4.28×105 CFU/cm2，随后管道内的生物膜均进入脱落期。至生物膜进入稳定期，以油漆内衬新旧管内，管壁生物膜中的HPC分别稳定在1.89×106~2.45×106 CFU/cm2和3.15×106~4.68×106 CFU/cm2，水泥内衬新旧模拟管道内壁生物膜中的HPC分别稳定在2.60×105~4.00×105 CFU/cm2和4.75×105~6.19×105 CFU/cm2。
邬卓颖等对供水管道中生物膜生长的影响因素研究表明，生物膜在铸铁管和铜管上的形成速率较PVC管和铝管快，与其他管材相比，铸铁管上单位面积生长的细菌数最多，而铸铁管的管壁粗糙度明显高于铝管。管道内壁的粗糙度是生物膜附着生长的重要因素，内表面粗糙度越大，微生物越易附着。本试验的结果表明成熟生物膜中油漆内衬管上的HPC数比水泥内衬管上的HPC数高一个数量级，且旧管内壁生物膜中的HPC达到稳定的速率比新管快，稳定时HPC数目明显高于新管。由表2可知，油漆内衬管无论是新管还是旧管，表面粗糙度均达到水泥内衬管表面粗糙度的10倍以上，考虑到模拟装置其他运行条件均一致，且根据饮用水卫生标准，油漆内衬和水泥内衬管的析出物质不得对水质产生较大影响，因此可判断，油漆内衬管材表面粗糙度大是造成管壁HPC数量多的重要原因。
2.2
微生物群落结构组成差异
对两套不同管材的模拟管道装置中成熟的生物膜（150 d和210 d）进行宏基因组测序，以得到生物膜中的微生物种群分布（图4）。
图4 不同管材的模拟管道内壁生物膜中细菌种群组成（门的水平）
由图4可知，以XJ水源水为进水的条件下，两种不同管材的模拟管道中，管壁生物膜中优势菌门是给水系统中的常见菌门，包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、绿弯菌门(Chloroflexi)等，然而各类优势菌门在两种管材的模拟管道内的丰度不尽相同。
油漆内衬管在运行150 d后，管中变形菌门的含量为49.68%，运行至210 d后，变形菌门相对丰度增至53.75%；运行150 d后水泥内衬管中变形菌门含量为55.08%，210 d后为56.80%。运行了150 d和210 d的油漆内衬管装置中拟杆菌门的含量分别为14.06%和11.03%，水泥内衬管则分别为24.36%和22.16%；蓝藻和酸杆菌门在不同管材装置中的丰度相近；厚壁菌门在运行了150 d和210 d的油漆内衬管中含量高达3.49%和4.03%，而水泥内衬管中的含量很少，仅为0.21%（150 d）和0.72% (210 d)。油漆内衬管中硝化螺旋菌门的含量为2.04%（150 d）与1.85% (210 d)，水泥内衬管中硝化螺旋菌门的含量为2.15%（150 d）与2.09%(210 d)。该结果与供水管道的相关研究中的结论类似，即不同管材中生物膜内细菌群落的分布存在差异，而原水输送管道内含氮污染物的转化是各种细菌共同作用的结果。
图5 不同管材的模拟管道内壁生物膜中微生物稀疏曲线
对测序序列进行随机抽样，将抽到的序列数与它们所能代表操作分类单元（OTU）的数目构建曲线，即稀释曲线。稀释曲线是评估样品中微生物群落多样性的分析方法之一，同时也可用以说明样本的取样大小是否合理。由图5可知，随着16S rDNA序列条带数目增加，曲线斜率不断减小而趋向平坦，最终取样数量的增加不会产生大量新的OTU，因此取样的数量合理。当原水管道的管材及粗糙度不同时，模拟管道生物膜中的微生物表现出不同的生物多样性。微生物稀疏曲线从高到低依次为油漆内衬旧管、油漆内衬新管、水泥内衬旧管和水泥内衬新管，而粗糙度从大到小也具有相同的排列顺序，这表明油漆内衬管生物膜中微生物多样性高于水泥内衬管，旧管生物膜中的微生物多样性高于新管。王薇等研究了管材对供水管道中生物膜微生物多样性的影响，结果显示，灰口铸铁管中生物膜微生物种群的多样性最高，镀锌管中的微生物多样性次之，不锈钢复合管中生物膜微生物种群多样性最低，管材表面的粗糙度、亲疏水性、是否带电荷等物化特性会很大程度上影响细菌的附着行为，总结以上可归纳为：管道中微生物种群多样性基本随着管材表面粗糙度的减小而降低。本研究的结果与王薇等的研究结果基本一致，粗糙度高的油漆内衬钢管中生物膜微生物多样性高于粗糙度低的水泥内衬钢管中生物膜微生物多样性。
2.3
进出水中含氮污染物含量的变化及其与微生物的关系
2.3.1
进出水中NH4+-N、NO2--N、NO3--N含量的变化
管壁生物膜通过自然培养成熟后（装置运行150~210 d期间），两种不同管材的模拟管道进出水中NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度变化率分别如图6~图8所示。
试验期间，XJ水源水中NH4+-N的浓度为0.451~1.847 mg/L，其NH4+-N的浓度偶尔超过《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）中Ⅳ类水中对NH4+-N浓度规定。由图6可知，生物膜成熟的模拟管道中，出水中NH4+-N的浓度均有一定程度的下降，说明原水在两套模拟管道输送的过程中均发生了明显的硝化反应。以油漆内衬管为管材的模拟管道出水中NH4+-N的浓度较进水降低了51.8%~66.3%，水泥内衬管为管材的模拟管道出水中NH4+-N的浓度较进水降低了42.8%~50.5%。
试验期间，XJ水源水中的NO2--N的浓度为0.005~0.086 mg/L。由图7可知，管壁生物膜生长成熟后的模拟管道中，以油漆内衬管为管材的管道出水中NO2--N浓度降低率为80.90%~97.9%，以水泥内衬管为管材的管道出水中NO2--N的浓度较进水降低了74.3%~92.3%。由此可见，两种不同管材的模拟管道中原水内的NO2--N几乎被完全去除，原因在于原水中NO2--N的浓度本身较低，NO2--N极易发生氧化反应被完全去除。
试验期间，XJ水源水中NO3--N的浓度为1.012~1.807 mg/L。由图8可知，生物膜生长至成熟状态的模拟管道中，两套管道出水中NO3--N的浓度均有一定程度的增长，以油漆内衬管为管材的管道出水中NO3--N的浓度较进水增加了37.2%~50.4%，以水泥内衬管为管材的管道出水中NO3--N的浓度较进水增加了23.4%~40.6%。
由图6~图8可知，当原水输送管道的管材分别采用油漆内衬钢管和水泥内衬钢管时，原水在两套模拟管道中输送的过程中均发生了硝化反应，相较于以水泥内衬管为管材的模拟管道，以油漆内衬管为管材的模拟管道中的硝化反应更明显，管道出水NH4+-N浓度降低率更大，NO2--N几乎被完全去除，出水中NO3--N的累积量也多。该结果的可能原因是在原水水质条件一致的情况下，当管材的管壁粗糙度更大、管材更易腐蚀时，管壁所附着的微生物量更多，进而生物膜中和硝化反应相关的功能菌更丰富，从而导致管道中的硝化作用加强。
2.3.2
含氮污染物变化率与微生物的关系
为了研究管壁生物膜内微生物种群相对丰度与含氮污染物浓度变化率的关系，本试验通过DCA分析得到LAG＜3，因此选择冗余分析（RDA）（图9），利用CANOCO，将8个优势菌门作为响应变量组，氨氮、硝态氮、亚硝氮、DON转化率为解释变量，用CCA分析剔除高度自相关变量，后用剩余变量分析影响管道内优势种群变化的份额，显著性以999的蒙特卡罗检验来考察。微生物群落箭头在含氮污染物转化率上的垂直投影长段，反映出两者相关性的大小，投影值越大，相关性越强，正投影值表示正相关，负投影值表示负相关。
由图9可知，NH4+-N、NO2--N的转化率与硝化螺旋菌门（P6）、拟杆菌门（P3）呈显著正相关关系而与绿弯菌门（P7）、酸杆菌门（P2）呈负相关关系。合理的解释可能是因为硝化螺旋菌中的氨氧化和亚硝化细菌容易在好氧条件下直接或间接参与了生物硝化作用，而本试验中进水DO浓度均大于2 mg/L，属于好氧条件，虽硝化螺旋菌门和拟杆菌门相对丰度在油漆内衬钢管中略低于水泥内衬钢管，但由于其微生物总量大，两者的绝对丰度值更大，而绿弯菌门、酸杆菌门相对数量虽高，但占比较小，因此抑制效果不明显，所以在油漆内衬钢管中表现出更高的NH4+-N、NO2--N转化率。NO3--N的转化率与厚壁菌门（P5）存在正相关关系，与浮霉菌门（P4）、放线菌门（P8）则表现出负相关性。厚壁菌门与浮霉菌门能在厌氧条件下进行反硝化和厌氧氨氧化反应，而本试验在好氧条件下进行，因此其功能受到一定的抑制，放线菌门在油漆内衬钢管中丰度较高，这也解释了NO3--N出水浓度高的原因。此外，拟杆菌门（P3）与DON转化率之间的显著负相关性，则说明了拟杆菌门相对丰度越高，更多的DON被释放。
2.3.3
进出水中DON含量的变化
管壁生物膜生长成熟的模拟管道装置中，两种不同管材条件下的管道进出水中DON的浓度变化率如图10所示。
试验期间，XJ水源水中DON的浓度为0.290~0.927mg/L。由图10可知，当管壁生物膜生长成熟后，两套管道出水中DON均有一定程度的增加，以油漆内衬管为管材的管道出水中DON的浓度较进水增加了67.7%~85.6%，以水泥内衬管为管材的管道出水中DON的浓度较进水增加了53.8%~78.6%。结合图3可知，油漆内衬管内生物膜中HPC的数量范围为1.89×106~2.45×106 CFU/cm2，水泥内衬管内生物膜中HPC的数量范围为2.60×105~4.00×105 CFU/cm2，比油漆内衬管中低了一个数量级。因此，在其他条件一致的情况下，油漆内衬钢管中的微生物数量更多，汲取了原水中更多的营养物质，产生了更多的代谢产物，导致原水在油漆内衬钢管内输送的过程中释放出更多的DON，该结果也与2.3.2节的结果一致。
2.3.4
进出水中DON分子量分布及亲疏水性差异
两套不同管材的模拟管道中进出水DON分子量分布及亲疏水性变化分别如图11、图12所示。由图11可知，XJ水源水中DON分子量分布以小分子（<5 KDa）为主，所占比例为62.2%~76.0%。而由图12可知，XJ水源水中亲水性DON所占比例为57.6%~64.2%。
图11 不同管材中DON分子量分布的变化（a为油漆内衬管，b为水泥内衬管）
图12 不同管材中DON亲疏水性的变化（a为油漆内衬管，b为水泥内衬管）
研究不同管材的模拟管道进出水中DON分子量分布变化发现，油漆内衬钢管出水中小分子DON所占比例达到88.3%~95.3%，水泥内衬钢管出水中小分子DON所占比例为84.6%~94.1%。结合图3可知，油漆内衬管内HPC的数量比水泥内衬管高了一个数量级，数量多的HPC生长代谢过程中产生更多的小分子DON。而由图4可知，油漆内衬管和水泥内衬管中拟杆菌门的丰度分别为14.06%和24.36%，由已有的研究结论可知，拟杆菌门在给水系统内有机物的降解和小分子DON的释放中发挥着重要的作用 。Amy等研究发现，水体中亲水性有机物主要来源于水源水中藻类的生长繁殖，分泌出氨基酸、氨基糖、缩氨酸和蛋白质等亲水性物质。XJ水源水中的营养物质存在水平较高，藻类物质较多，从而导致两种管材的模拟管道中亲水性DON均有大幅度增加。因此，两套不同管材的管道出水中小分子DON的含量差异不大，是由管道中HPC的数量、拟杆菌门的丰度以及其他生物因素共同作用的结果。
DON中的胺类（NH2）、硝基（NO2）、酰胺（CONH2 或CONH-R）和腈类（CN）等多种含氮官能团，是水中DON的亲水性组分，通过研究不同管材条件下模拟管道进出水中DON亲疏水性变化发现，XJ水源水中亲水性DON占比略高于疏水性DON，为57.6%~64.2%。两套模拟装置出水中DON亲疏水性差异不大，以油漆内衬管和水泥内衬管为管材的管道出水中亲水性DON占比分别为78.8%~84.9%和72.8%~80.2%，较管道进水均上升约20个百分点。由此认为，不同管材对原水输送中DON亲疏水性变化无显著影响。
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结论
（1）两套不同管材的模拟管道经相同运行时间后，管材表面粗糙度较高的油漆内衬新管的模拟管道内管壁生物膜中的HPC稳定在1.89×106~2.45×106 CFU/cm2，高于水泥内衬新管的2.60×105~4.00×105 CFU/cm2，旧管中生物膜的HPC数目普遍高于新管。
（2）不同管材条件下，管道内壁生物膜中优势菌门基本一致，各优势菌门的含量不同。管道中微生物种群多样性基本随着管材表面粗糙度的降低而降低。冗余分析表明NH4+-N、NO2--N的转化率与硝化螺旋菌门、拟杆菌门相对丰度呈显著正相关，而与绿弯菌门、酸杆菌门呈负相关。NO3--N的转化率与厚壁菌门相对丰度正相关，与浮霉菌门、放线菌门表现出负相关性。拟杆菌门与DON转化率之间呈显著负相关关系。
（3）油漆内衬钢管中拟杆菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门相对丰度略高于水泥内衬钢管，此前者的NH4+-N、NO2--N转化率和NO3--N出水浓度略高于后者；较高的HPC数目使油漆内衬钢管原水管道出水中出现更多的小分子DON，出水中DON的浓度比进水增加了67.7%~85.6%，水泥内衬钢管出水中DON的浓度比进水增加了53.8%~78.6%，而管材对DON亲疏水性的变化影响不显著。
推荐参考
陈桃源,周正协,陈卫,等.管材对原水输送管道中微生物群落结构及氮素转化的影响[J].净水技术,2018,37(11):22 -31 .
Chen Taoyuan, Zhou Zhengxie, Chen Wei, et al. Effects of pipe materials on microbial community structure and nitrogen transformation in raw water diversion pipelines[J]. Water Purification Technology, 2018,37(11): 22-31 .
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