【生物刺激素】海藻提取物的研究和应用
海带（Laminaria japonica）又名昆布，是生长于海洋中的大型褐藻，归属于光能自养型微生物，是我国历史最悠久的食用及药用藻类之一。我国的褐藻资源丰富，海带在我国北部及东南沿海地区均有大量养殖，是养殖规模最大的重要经济藻类，具有独特的工业和食用价值。海带常年生长在低温的环境中，生长速度快、适应能力强，藻体中含有大量陆生生物不具有的营养物质和生物活性成分，作为植物生物刺激素在农业中有着广阔的开发和应用前景。
本文引用格式：
陈营，孙业梅，杨丹丹，等.海带发酵降解的复合菌种筛选及海藻寡糖产物的检测[J].肥料与健康，2020，47(5)：59-63.
以海带为主要原料制备海藻肥料，通常采用化学、物理和生物的方法提取海带的有效成分，其中的标志性物质是海藻酸。经过提取处理后，海带藻体结构被破坏，释放出细胞内的全部营养物质。而海藻酸或其黏度降低，或变成小分子海藻寡糖，水溶性和吸收度增大，呈现更多的生物活性作用，如植物生长的刺激作用和植物抗病力的诱导效应。
在海藻的各种提取方法中，生物法因其条件温和可控、特异性强、绿色无污染，日益受到人们的重视。因此，筛选海带降解菌或降解酶，最大程度地保证海藻有效成分的完整性，对海藻提取物的应用是至关重要的。目前，大部分的海带降解菌或降解酶都源于海洋细菌，如弧菌（Vibrio）、交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）、交替单胞菌（Alteromonas）、芽孢杆菌（Bacillus）、Shewanella、Tamlana。生物法的优势除了反应温和、无营养损失外，其产物也独具特殊性。海藻酸经过微生物酶的裂解后，其产物海藻寡糖的非还原端C4与C5间会产生一个双键，在波长235 nm处有最大吸收峰，通过比色法可以测定海藻寡糖的含量。
本文从实验室保存的海带降解菌群中分离纯化出相关的海带降解菌，通过分析菌种之间的相互作用，检测发酵产物中海藻寡糖的组成和含量，筛选并重新组成复合微生物菌种，用于海带发酵降解制备海藻寡糖的研究。
材料与方法
材料
样品，购于烟台本地市场的干海带；菌种，本实验室保存于海带发酵液中的海带降解菌群；培养基，富集培养基等参考文献［17］。
试验方法
（1）海带降解菌群的活化及分离纯化
取保存的海带发酵液，按5%（体积分数，下同）接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养至海带片90%以上分解。继续传代培养2次，直至海带分解效果稳定。取海带降解液进行适当稀释后，涂布牛肉膏蛋白胨平板。待平板上有菌落生长后，选取形态不同的菌落反复几次划线培养，纯化后的菌种留待备用。
（2）微生物菌种之间的相互作用分析
a.交叉划线法
将纯化的菌种两两之间在牛肉膏蛋白胨平板表面交叉划线，培养后在两种菌交叉的地方观察细菌生长情况。交叉处细菌的生长如果优于单一划线处的细菌，说明两种菌之间有相互促进的作用；反之，说明细菌之间没有相互促进作用。
b.滤纸片法
先选择一种菌液涂布于平板表面，然后将灭菌的滤纸片浸入其他的菌悬液中，待滤纸片微干后贴于培养基表面，培养后观察滤纸片周围细菌的生长情况。若滤纸片周围的细菌生长得更好，说明两细菌之间有相互促进作用；反之，则无作用。
（3）海带的混合发酵与海藻寡糖含量的测定
取纯化的菌种，以等比例混合接种至富集培养基中，在37 ℃、160 r/min下培养4 d。以各自单一菌种接种富集培养基和空白培养基作对照，每组均为两个平行。发酵结束后，取各自海带发酵液以4000 r/min离心10 min，再取上清液稀释40～50倍，在波长235 nm下测定吸光度，即可比较各发酵液中海藻寡糖含量的差异，从而确定海带分解的效果。
（4）海带发酵复合菌种的比例分析
从上述海带的混合发酵中，选取海带分解达到90%以上和海藻寡糖含量较高的组合，采用平板培养法对最终发酵液中的菌种计数，确定混合发酵的接种比例。
（5） 复合菌种发酵产物的薄层层析
薄层层析所用展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶冰乙酸∶水（2∶6∶6∶4∶1）。将点样的硅胶板放于盛有展开剂的层析缸中，在50 ℃下待样品扩散至距硅胶板顶端约1 cm处，取出在70 ℃烘烤30 min。烘干后，均匀喷体积分数为30％的硫酸溶液进行显色，并在110 ℃烘烤10 min后观察。以质量分数为1%的葡萄糖、蔗糖溶液作为对照。
（6）混合发酵复合菌种的鉴定
试验采用煮沸法提取细菌基因组，并进行16S rDNA测序鉴定。PCR扩增引物为细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。
结果与分析
海带降解菌的分离和纯化
对实验室保存的海带发酵液进行连续传代培养，在37 ℃、160 r/min条件下培养3～4 d，海带分解达到90%以上。这是一个海带降解菌群的富集培养液，经过近3年的保存，其混合菌群的种类逐渐变少，但降解海带的效果仍然很好。经平板涂布分离及划线纯化后，共获得3种不同菌落形态的菌株，分别命名为Lj1、Lj2和Lj3。
微生物菌种之间的相互作用
在交叉划线试验中，Lj1和Lj2交叉划线处的细菌生长优于单菌生长，两菌株之间可能存在相互促进作用；Lj2和Lj3交叉划线处的细菌生长较差，不如单菌生长，两菌株之间可能有抑制作用；Lj1和Lj3之间的关系不是很明显。
在交叉划线试验的基础上进行滤纸片法分析，先将Lj2涂布于平板上，再将浸有Lj1和Lj3 的滤纸片贴在平板表面。结果表明：Lj2的代谢产物促进了Lj1的生长，进一步确定了两者之间的协同作用；Lj2和Lj3之间作用不明显或没有促进作用。
海带发酵复合菌种的筛选
经过检测混合发酵液中海藻寡糖的含量，以Lj1 Lj2组合的含量最高，稀释50倍后的平均吸光度为0.784，其次为Lj1 Lj3和Lj2 Lj3组合。3种菌株的组合和单一菌株发酵液中，海藻寡糖含量均较低，与空白对照相当，结果见图1。
结合海带的分解效果，也是Lj1 Lj2组合中的海带分解最好，在3～4 d可使质量分数30%的湿海带分解率达90%以上。因此，选用Lj1 Lj2组合作为海带发酵降解的复合菌种。
结语
海带的细胞壁组成十分复杂，含有海藻酸和其他的多糖成分，这些可以成为微生物生长繁殖的营养物质和能源。只有能利用这些物质的微生物才能将其降解成小分子，破坏细胞壁的保护结构，释放出细胞内的营养物质。因此，利用不同菌种的代谢酶系，可以更好地协同作用，更快、更有效地降解海带。
从实验室保存的海带降解菌群中共获得3株细菌，通过分析两种不同方法的菌种之间的相互作用，得出Stappia indica和Pseudomonas taeanensis之间有协同促进作用；对不同菌种组合的海带发酵产物进行235 nm光吸收检测，也表明这两个菌种组合产生的海藻寡糖含量最高，分解海带的效果最好，而任一单菌种或其他组合效果都不好。所以，后续的研究选用Stappia indica和Pseudomonas taeanensis作为海带发酵降解的复合菌种。
试验分离的假单胞菌是自然界中利用碳源物质能力最强的细菌，如海带含有的各种多糖。在与斯塔普氏菌混合发酵海带的过程中，假单胞菌产生的代谢产物促进Stappia indica的生长，两者共同作用使海带降解。Stappia indica在这个过程中可能具有独特针对海带中某种成分的利用和分解能力，有待进一步验证。此复合菌种在4 d之内可使质量分数30%的湿海带几乎全分解，而且产物经薄层层析推测为单一的三糖。
菌种的组合不同、反应条件不同，对海带的降解效率和产物组成是有差异的。为实现海带发酵降解的工业化生产，后续还将进行菌种的稳定性和发酵工艺优化的研究。同时，亟待建立检测海藻寡糖的方法并制定相应的标准。
编辑：郭俊 | 审校：张巍 | 监制：师蓉