单细胞测序技术为乳腺癌精准治疗提供新机遇
乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的首要原因。传统高通量测序技术对乳腺癌的研究主要是鉴定与乳腺癌发生发展相关的"驱动基因"，但是对于乳腺癌基因组结构变化以及亚克隆的鉴定等存在一定的局限性,并且忽略了乳腺癌肿瘤细胞之间的异质性。由于缺乏对乳腺癌肿瘤微环境(TME)的了解，乳腺癌靶向治疗的发展往往受到阻碍。近年来兴起的单细胞测序技术可以对单个细胞进行高通量和高分辨率的分析。它包括单个细胞的分离，单个细胞基因组或转录本的分析，以及单个测序库的生成，并且可以揭示单个细胞的状态和功能(图1)。而目前单细胞测序技术的最新进展已经能够实现对多达数万个细胞进行同时分析，因此这种方法特别适合于解剖乳腺癌复杂的肿瘤微环境，并评估乳腺肿瘤内及周围细胞群体的异质性，进而为乳腺癌的精准治疗提供新的可能。
图1：单细胞测序工作流程
//1.探索乳腺癌肿瘤异质性与患者预后及临床治疗的关系
近年来，基于大量肿瘤样本的基因表达谱研究已经确定了多个用于靶向治疗的特异性标记物。然而，由于乳腺癌肿瘤内的异质性，其特定靶向治疗的治疗反应和临床结果往往受到限制。单细胞RNA测序技术可以在单细胞分辨率下评估肿瘤细胞的遗传异质性，从而有助于阐明肿瘤的生物学复杂性。
乳腺癌肿瘤细胞的异质性(VilmaPetrikaitė, et al. Life Sciences. 2019)
例如，Chung W, et al.(2017)通过分析11例乳腺癌患者(包括luminal A型、luminal B型、HER2阳性以及三阴乳腺癌)的515个乳腺肿瘤细胞的转录本后发现，从HER2阳性肿瘤中分离出的细胞高度多样化，主要表现为HER2和三阴性乳腺癌(TNBC)表型。此外，从ER/HER2双阳性肿瘤中分离出的细胞通常是ER亚型，这是因为HER2模块基因的低表达和ER信号通路的激活。因此，单细胞分子图谱可以帮助识别ER途径显著激活的ER/HER2双阳性肿瘤，并且该肿瘤类型可能受益于强化内分泌治疗。
另外，Wagner J, et al.(2019)研究发现，所有临床亚型的肿瘤都由多个表型不同的细胞组成，尽管其中一种特定的表型通常是占主导优势的。并且，表型优势对肿瘤进展和治疗耐药至关重要。例如，占主导地位的ERa−HER2−Survivinhigh表型与新辅助化疗耐药有关；luminal B亚型肿瘤中，ER+细胞的频率与乳腺癌肿瘤微环境中的PD-L1+肿瘤相关巨噬细胞以及耗竭T细胞的表性相关，并且影响免疫检查点抑制剂的疗效。因此，通过单细胞测序技术了解患者的肿瘤异质性，可以选择合适的治疗方案并改善患者预后。
此外，单细胞分析还可用于探索抗肿瘤治疗后耐药细胞亚群，为后续抗肿瘤治疗提供指导。
众所周知，三阴乳腺癌(TNBC)的特点是广泛的肿瘤内多样性。目前研究发现，对新辅助化疗未能达到病理完全应答(pCR)的患者通常预后较差，这表明存在一小部分对常规化疗有耐药性的细胞亚群。根据这一假设，Karaayvaz et al.(2018)通过scRNA-seq技术分析了6个原发TNBC肿瘤，并从中鉴定出5个不同的上皮细胞亚群。并且这些细胞亚群与患者的生存预后密切相关。其中最具代表性的是富含鞘糖脂和天然免疫途径特征的细胞亚群，该亚群与患者不良结局有关。
Wang et al.(2019)最近在CDK4/6抑制剂耐药肿瘤中发现了一种独特的免疫抑制不成熟髓系细胞(immature myeloid cell, IMC)群体。通过单细胞转录组分析，研究者证明IMC靶向酪氨酸激酶抑制剂cabozantinib和免疫检查点抑制剂联合治疗可提高抗肿瘤免疫能力，并克服耐药性。
还有，Jang et al.(2020)研究发现抗放射性治疗的肿瘤细胞与较高的PD-L1阳性率及肿瘤突变负荷(TMB)相关。此外，与luminal和HER2阳性亚型相比，三阴乳腺癌细胞表达更高水平的免疫检查点分子，因此，采用放疗和免疫检查点抑制剂联合治疗的方法可有效治疗对辐射敏感且PD-L1过表达及高TMB的三阴乳腺癌患者。
最后，Vu et al.(2019)等开发了一种从scRNA-seq分析中发现细胞水平突变信息的新技术，而特定的体细胞突变往往与乳腺癌的临床治疗效率有关。例如，GATA3突变预示着对芳香化酶抑制有更好的反应；PI3K或ERBB2突变可能使HER2阳性乳腺肿瘤对新辅助化疗(多西紫杉醇、卡铂)与抗HER2治疗(曲妥珠单抗、拉帕替尼)联合治疗敏感，该技术拓展了scRNA-seq在肿瘤研究中的应用。
综上，我们可以发现单细胞测序技术是一种很有应用前景的工具，可用于识别与TMB或免疫检查点相关的新标记物，为临床用药提供指导，另外也能够更加准确地预测个体化药物反应。
//2. 乳腺癌治疗新靶点-肿瘤相关成纤维细胞
肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤微环境中是一个异质性群体，根据其特定的表面标志可以被分为不同的亚群。然而，它们的起源以及在肿瘤内的发生、发展和治疗反应中的作用还不是很清楚。scRNA-seq技术已在乳腺癌肿瘤中鉴定出不同的CAF类型，它们可能起源于不同的亲本细胞，且主要参与免疫细胞向肿瘤的募集和诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转化。
乳腺癌两种主要肿瘤相关成纤维细胞亚型及其功能(Xueqi Yan, et al. J Exp Clin Cancer Res. 2021)
最近，有研究者根据成纤维细胞活化蛋白(FAP)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、整合素β1(CD29)将乳腺癌中的CAF分为CAF-S1、CAF-S2、CAF-S3和CAF-S4四个亚群。其中CAF-S1可以通过招募Treg细胞促进肿瘤微环境的免疫抑制，但其异质性及其对免疫治疗反应的影响尚不清楚。
为了探索CAF-S1细胞亚群的功能，Kieffer et al.(2020)使用scRNA-seq技术分析了乳腺癌中超过19000个单一的CAF-S1细胞，确定了8个CAF-S1细胞簇。其中3个为炎症性CAF(iCAF)(1，2，5)，5个为纤维母细胞性CAF(myCAF)(0，3，4，6，7)。其中第0簇增加了FOXP3+Treg细胞表面PD-1和CTLA4的表达，而CD4+CD25+T细胞促进了第0簇向第3簇的转化。这表明免疫抑制的CAF-S1亚群和Treg细胞之间存在正反馈循环，可能介导了免疫治疗耐药。相反，第4簇与高T细胞浸润相关，但在免疫治疗无效的肿瘤中富集。因此，在高T细胞浸润的肿瘤中，簇4是一个潜在的免疫耐药的替代标记物。综上所述，在乳腺癌诊断过程中，CAF-S1图谱分析可以增加浸润CD8+T细胞和Treg细胞数量用以区分有反应者和无反应者的预测价值。另外PD-1和/或CTLA4抑制剂联合CAF-S1靶向治疗乳腺癌值得研究者进行进一步的探索。
此外，CAF还有很多其他类型分类。Bartoschek et al.(2018)通过对乳腺癌基因工程小鼠模型的768个CAF细胞进行单细胞转录组分析后，将其定义为3个不同的亚群：血管CAF(vascular CAF, vCAF)，基质CAF(matrix CAF, mCAF)，周期CAF(cycling CAF, cCAF)和发育CAF(developmental CAF, dCAF)，且这三种亚群可能分别来自血管周围位置、驻留的成纤维细胞以及发生上皮-间充质转化的恶性细胞。其中，vCAF或mCAF信号可以预测患者预后，另外，mCAF还可以预测乳腺癌对新辅助化疗的耐药性。
除上述研究外，Wu et al.(2020)对5个三阴乳腺癌患者的间质细胞进行单细胞RNA测序，发现4种不同状态的肿瘤相关成纤维细胞亚群：myCAFs、iCAFs、分化的血管周样细胞(differentiated perivascular-like, dPVL)和未成熟的血管周样细胞(immature perivascular-like, dPVL)。在三阴乳腺癌患者队列中，iCAFs基因特征与毒性T淋巴细胞功能障碍密切相关。另外研究者还发现iCAFs和dPVL亚群在多个独立的三阴乳腺癌队列中与免疫逃避密切相关，因此可以作为乳腺癌潜在的治疗靶点。
综上所述，scRNA-seq技术可以显著提高CAF的细胞分辨率，并证明至少存在三个空间上和功能上不同的乳腺癌CAF亚群。iCAF、vCAF和mCAF信号在乳腺癌肿瘤样本中高度保守，且这些细胞亚群与患者的细胞毒性T细胞功能障碍以及肿瘤细胞转移密切相关，同时也为开发更高分辨率的新型靶向药物或生物标记物提供了可能性。
//3. 表征免疫细胞与免疫治疗的关联
越来越多的研究表明，免疫细胞在肿瘤进展和治疗反应中起着重要作用。针对CTLA-4和PD-1的免疫治疗的疗效在乳腺癌患者间存在很大的差异，这归因于肿瘤间免疫细胞的异质性。T细胞和髓样细胞是肿瘤中含量最丰富的细胞亚群，因此其与患者的临床治疗反应可能最为相关。已有研究表明，实体瘤中过表达转录因子Foxp3的 Treg细胞显著增加；同样，与抑制肿瘤进展的促炎M1型巨噬细胞相比，肿瘤相关巨噬细胞中促进肿瘤生长和转移的M2型巨噬细胞的比例相对较高；此外，B细胞、NK细胞、DC细胞等也在肿瘤微环境中发挥着重要作用。然而，正常组织和肿瘤组织之间的免疫细胞状态是否不同仍有待进一步阐明。
免疫细胞与免疫治疗(Zemin Zhang, et al. Nature. 2020)
3.1 T细胞
对于乳腺癌患者尤其是三阴乳腺癌患者，浸润肿瘤的T细胞数量和类型是决定治疗和预后的关键因素。肿瘤内的T细胞群体往往存在异质性，表现为Tregs细胞富集，CD8+T细胞转变为耗竭或组织驻留记忆(TRM)表型。与此同时，抗炎、耗竭、缺氧和无变应性基因表达上调，免疫治疗靶基因差异表达。因此，肿瘤内T细胞的状态是预测患者预后状态以及治疗反应的潜在标志物。
Azizi et al.(2018)使用scRNA-seq分析了来自8个乳腺癌患者的45000个免疫细胞，以及与之匹配的正常乳腺组织、血液和淋巴结。与正常组织相比，细胞毒性T细胞、Treg细胞和活化的肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤组织中更为丰富，初始T细胞在血液中高度富集，B细胞在淋巴结中更为普遍。此外，肿瘤内的T细胞被组成性地激活，并在分化过程中以多个瞬时群体的形式存在，而不是几个离散和稳定的状态。这些发现对乳腺肿瘤浸润性免疫细胞的表型多样性提供了一些新的见解，并可能有助于更好地理解癌症进展的机制和治疗反应。
另外，不同乳腺癌亚型肿瘤细胞内的T细胞状态也存在明显的差异。例如，在luminal B型乳腺癌患者的原发部位处，T细胞表现出幼稚/早期共刺激信号特征，而在淋巴结中，T细胞普遍表现出共刺激信号特征。相反，HER2阳性和三阴乳腺癌患者肿瘤细胞内的T细胞往往表达IL2RA等调节信号。此外，在三阴乳腺癌肿瘤浸润的免疫细胞中也检测到高表达细胞因子和趋化因子的T细胞，且表现为免疫抑制耗竭或调节性表型。虽然这些细胞只表达适度水平的PD-1，但其他抑制性受体，如TIGIT和LAG3，已经被频繁检测到，并且是检查点抑制剂的潜在靶点。
尽管T细胞是肿瘤浸润淋巴细胞的主要群体，但T细胞亚群的定量和定性差异与患者预后之间的关系仍不清楚。Savas et al.(2018)从人乳腺癌组织中分离出6311个T细胞，并鉴定出一个新的组织驻留记忆CD8+T细胞亚类(TRM)，并且TRM基因特征在TNBC组织中比在其他乳腺癌亚型中更为丰富。之前有研究报道，乳腺癌中的CD3+CD8+T细胞主要为效应记忆T细胞(TEM，CCR7−CD45RA−)和重新表达CD45RA的效应记忆(TEMRA，CCR7−CD45RA+)表型(Azizi E, et al.(2018))。但是通过TCR测序显示，TRM和TEM细胞的TCR谱系并不重叠，表明其具有不同的抗原特异性。另外，TRM细胞还是免疫检查点抑制剂的潜在靶点，晚期乳腺癌患者高TRM细胞频率可能预示着对抗PD-1治疗有较好的反应。最后，TRM细胞的富集程度还与早期三阴乳腺癌患者的预后改善和总生存期(OS)的延长有关。总而言之，进一步了解TRM细胞的发育、维持和调控对于乳腺癌免疫治疗的成功发展至关重要。
Wagner et al.(2019)使用单细胞蛋白质组学技术破译了不同乳腺癌亚型的免疫状态，发现与转录分析一致的是，肿瘤相关的T细胞簇以连续分化表型的形式存在于CD4+和CD8+T细胞中，其中大多数具有CD197lowCD45RAlow记忆效应表型。此外，在ER−和高级别ER+肿瘤中，Treg细胞和耗竭T细胞的频率较高，这可能是这类患者对免疫检查点抑制剂反应较好的细胞基础。因此更好地了解乳腺癌免疫微环境中肿瘤与免疫的关系有助于免疫治疗的患者分层。
3.2 髓系细胞
髓系细胞是一个异质性群体，包括粒细胞和单核巨噬细胞，它们在抗肿瘤免疫中起着关键作用。单核/巨噬细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，通过识别和吞噬病原体在先天免疫中发挥作用，并通过向T细胞递呈抗原在获得性免疫中发挥辅助作用。另外多项靶向髓系免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage, TAM)和树突状细胞(Dendritic cell, DC)的治疗策略已进入临床前试验。然而这些细胞在乳腺癌肿瘤微环境中的特征，其与T细胞等其他细胞的相互作用关系，以及其靶向药物的作用机理尚未得到全面阐释。
3.3 NK细胞
NK细胞是典型的先天淋巴样细胞，它可以通过产生溶细胞颗粒直接消灭肿瘤细胞，或者通过分泌促炎细胞因子和趋化因子间接激活其他免疫细胞。Bötttcher等人研究发现，肿瘤驻留的NK细胞招募cDC1细胞来促进抗肿瘤免疫，而肿瘤细胞可以通过释放前列腺素E2削弱NK细胞的功能，从而导致免疫逃避。因此，NK细胞也是免疫治疗的潜在靶点。然而，在乳腺癌肿瘤微环境内，研究者对于NK细胞在单细胞水平的功能仍知之甚少，因此，需要进一步的研究和探索。
3.4 B细胞
B细胞是适应性体液免疫的中介细胞，在抗原刺激下分化为记忆B细胞或分泌免疫球蛋白的浆细胞。
目前研究发现，肿瘤浸润性B细胞(TIB)表现出相当大的表型和功能多样性，并且可通过作用于髓系细胞或癌细胞的旁分泌介质抑制T细胞介导的免疫反应，从而促进肿瘤进展(Ammirante M, et al.(2010))。
为了了解乳腺癌化疗诱导的B细胞抗肿瘤免疫反应，Lu et al.（2020）对乳腺肿瘤治疗前后肿瘤浸润的B细胞进行了scRNA-seq分析后发现，在新辅助化疗后，出现了ICOSL+B细胞亚群，且部分或完全缓解组ICOSL+B细胞数量明显高于稳定期或进展期患者，提示此亚群与疗效改善有关。另外，ICOSL+B细胞富集是乳腺癌患者无病生存期和总生存期的独立的积极预后因素。
B细胞在乳腺癌化疗诱导免疫治疗中的作用(Yiwen Lu, et al. Cell. 2020)
此外，Hollern et al.(2019)研究发现，免疫检查点抑制剂可诱导三阴乳腺癌患者中滤泡辅助T细胞和B细胞的激活，激活的B细胞通过分泌抗体和向T细胞呈递抗原来促进抗肿瘤反应。因此，作为检查点抑制剂应答机制的B细胞驱动的T细胞活化可以增强免疫检查点抑制剂的疗效。然而，尽管这些发现强调了B细胞在抗肿瘤免疫调节中的关键作用，但是其是否可以作为免疫治疗的靶点还尚不清楚，因此研究者还需要进一步的探索来揭示其潜在的作用机制。
结 论
目前，临床工作者迫切需要寻找新的乳腺癌预后生物标志物和治疗靶点，以改善患者的预后和生存期。单细胞检测技术，包括scRNA-seq、scDNAseq以及质谱流式细胞术，有助于剖析复杂的乳腺癌微环境，揭示影响抗肿瘤反应的不同细胞亚群。单细胞检测还可以用来检测治疗后耐药细胞亚群的出现，这可能对现有或新的靶向药物的二线治疗决策具有重要的临床意义。总体而言，将单细胞检测整合到基础和临床转化研究中，可以通过确定潜在的治疗靶点来开发新药，并揭示有希望的生物标志物来监测治疗效果和指导治疗决策，从而促进个性化治疗。
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