摘 要：目的 以经典名方桃红四物汤养血、活血、逐瘀功效为核心，通过构建“成分-靶点-通路-疾病”作用网络探讨其临床异病同治的作用机制。方法 利用生物科学与网络药理学平台、蛋白数据库和String数据库收集桃红四物汤化学成分及其相关靶点数据，建立“成分-靶点”作用网络；基于筛选得到的靶点，对桃红四物汤治疗的疾病进行关联分析，建立“靶点-疾病”网络；进而开展基因本体论（geneontology，GO）和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）通路富集分析桃红四物汤治疗疾病的关键通路；同时将筛选得到的关键有效成分和核心靶点进行分子对接验证，综合探讨桃红四物汤在临床上异病同治的复杂作用网络。结果 从桃红四物汤中筛选出40个活性化合物，其中32个成分涉及221个相关靶点、286种相关疾病。其中阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚、芍药苷、藁本内酯、咖啡酸能匹配到较多靶点。预测到桃红四物汤可治疗疾病主要包括3大类，分别为癌症相关疾病（乳腺癌、前列腺癌等）、心血管疾病（高血压、心肌梗死、心脏衰竭）、神经系统疾病；核心靶点蛋白涉及RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、血清白蛋白、白细胞介素17、血管内皮生长因子A、转录因子AP-1等；KEGG信号涉及促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增生、免疫调节、血液循环系统调节、内分泌调节等多种生物过程的165条通路。结论 构建了桃红四物汤“成分-靶点-通路-疾病”之间的关联，一定程度上揭示桃红四物汤多成分、多靶点的复杂作用机制，为经典名方桃红四物汤的临床广泛应用提供理论基础。桃红四物汤是古代经典名方目录（第1批）中收载的百首经典名方之一，也是国家最早发布古代经典名方关键信息的7首方剂之一。该方出自清代柴得华《妇科冰鉴》，处方组成为生地（3钱，酒洗）、当归（4钱，酒洗）、白芍钱（5分，酒炒）、川芎（1钱）、桃仁（14粒，去皮尖研泥）、红花（1钱，酒洗），功效为“养血、活血、逐瘀”[1]。该方最早见于清代吴谦所著《医宗金鉴·妇科心法要决》，是在妇科圣方四物汤（补血活血）的基础上，加桃仁-红花药对增强活血化瘀之功，对血瘀而兼有血虚者尤为适宜，适用于血瘀引起的多种病症[2-3]。按照《医林改错》记载，根据病变部位不同，“血瘀”可分为头部、胸部、腹部、少腹部、肢体经络5个方面，其代表疾病依次为脑梗死[4-5]、冠心病和心绞痛[6-9]、高血压[10]、肝硬化[11]、月经失调[12]、类风湿性关节炎[13]等，桃红四物汤均可治之。桃红四物汤已成为中医临床使用最广泛的活血化瘀方剂之一，也是异病同治的典型方剂。课题组前期对该方剂的化学成分、药理作用及临床应用进行文献挖掘[14]，发现其较多临床应用的治疗作用机制研究还不深入、缺乏实验研究基础。中药复方化学成分复杂，临床疗效的表现是其多成分、多靶点、多途径的协同作用，桃红四物汤以其养血和活血化瘀功效为核心应用于多种疾病的治疗，其成分-靶点-通路-疾病之间的交互作用网络如何关联，是该方剂现代应用中亟待探究的关键问题。随着组学技术的发展完善，系统生物学及多向药理学已广泛应用于多种疾病及药理、毒理等方面研究。网络药理学（network pharmacology）融合了系统生物学和多向药理学的思想，通过构建“成分-靶点-通路-疾病”之间的复杂网络分析药物有效成分的作用机制，使药理研究由寻找单一靶点的传统研究理念转向了网络综合分析思维，已经开始逐步渗透到中医药领域的各个方面，系统科学地解析中药或中药复方。网络药理研究中，同一疾病在不同发展阶段，可由不同的蛋白（或基因）调控；部分蛋白亦可在多种疾病中起中枢调控作用，与“同病异治”和“异病同治”的中医药理论不谋而合。本研究采用网络药理学的方法，以桃红四物汤活血化瘀功效为核心，系统综合地探寻桃红四物汤对疾病网络的干预与影响，探索其多成分与多靶点、多疾病之间的复杂关系，从系统生物学整体水平揭示其潜在有效成分和药理作用机制，为其基础研究和临床应用奠定理论基础。
1 方法
1.1 研究思路
本研究基于网络药理学的桃红四物汤主要成分与作用机制关联分析研究思路见图1。
1.2 桃红四物汤有效成分筛选
据库及分析平台（traditional Chinese medicine TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中筛选出桃红四物汤现有成分的数据；以药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18，小肠渗透率（Caco-2）≥0.4为标准。同时，结合课题组前期研究结果及文献检索对有效活性成分进行完善。
1.3 桃红四物汤化学成分潜在靶点预测、蛋白-蛋白相互作用网络构建与分析及疾病预测
将筛选得到的有效成分在TCMSP中预测相关靶点，将获得的桃红四物汤潜在靶点数据导入STRING 11.0软件（http://string-db.org），并将物种限定为“homo snpiens”。选取置信度高于0.9的数据，构建桃红四物汤的蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络，根据网络中基因与邻接基因的数目，找出网络的核心基因。将筛选得到桃红四物汤潜在作用靶点作为关键词，在TCMSP中匹配靶点所对应的疾病。
1.4 网络构建与分析
将“药材-成分”“成分-靶点”“靶点-疾病”文件输入Cytoscape 3.7.2构建桃红四物汤“药材-成分-靶点”“疾病-靶点”网络图。在网络中，药材、成分、靶点、疾病是由节点来表示，两个节点之间的相互作用由边来表示。
1.5 基因本体论（gene ontology，GO）和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG）通路富集分析
使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）对核心靶点及PPI核心基因进行GO生物学过程富集分析；使用KEGG（http:// www.kegg.jp/）对靶点进行通路注释，筛选P≤0.05的显著途径进行聚类分析。
1.6 分子对接验证
使用AutoDock软件（4.2版）进行分子对接，该软件采用Lamarckian遗传算法验证复合靶的关联性。在Autodock工具中准备蛋白质和配体，目标蛋白的三维结构从RCSB-PDB数据库（http:// www.pdb.org）下载。对接数据库进行再对接，加入氢原子，通过Auto工具计算对接结合能，探讨成分与靶点之间的结合作用。通过程序Pymol绘制靶点蛋白和分子的对接图。
2 结果
2.1 活性成分筛选
2.2 桃红四物汤作用靶点预测及PPI网络构建
本研究利用TCMSP靶点预测技术对上述活性成分进行作用靶点预测，排除重复靶点，共获得32个化合物对应的预测靶点221个。将靶点蛋白对应的基因输入String数据库获取PPI网络，网络中含有220个节点，798条相互作用关系。利用String绘制得分前30个PPI蛋白的互作网络图，见图2。利用Cytoscape3.7.2的Cytohubba插件中的degree算法筛选出得分前30的蛋白作为Hub蛋白，见图3。其中关键靶点包括：RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonineprotein kinase，AKT1，120）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial 106）等。
2.3 构建“疾病-靶点”网络
将221个相关靶点蛋白在TCMSP数据库中进行匹配，其中92个靶点蛋白可匹配286种疾病，129个靶点蛋白未能匹配到相关疾病。根据靶点蛋白与疾病的关系可以构建“疾病-靶点”网络，涉及92个靶点，286个疾病，为了能够更加直观地探析桃红四物汤治疗疾病的作用机制，本研究对286种疾病的degree值进行计算，分析得到的关键疾病主要为癌症相关疾病（乳腺癌D43、前列腺癌D33等）、心血管相关疾病（高血压D10、心肌梗死D47、心脏衰竭D11）、神经系统相关疾病（阿尔茨海默病D3），见图4。从中筛选代表性疾病（乳腺癌、高血压），根据桃红四物汤成分、靶点蛋白与疾病的关系构建“成分-靶点-疾病”网络，见图5。
2.4 桃红四物汤作用靶点预测及“药材-成分-靶点”网络构建
利用Cytoscape 3.7.2将筛选得到的有效成分和预测得到的相关靶点，进行关系网络绘制和分析，桃红四物汤发挥重要作用的有效成分与对应的作用靶点的相互关系共546个，见图6。
2.5 GO和KEGG通路富集分析结果
将221个基因输入DAVID Bioinformatics Resources 6.8，得到646条GO条目与生物学过程有关，参与促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增生、免疫调节、内分泌调节、血液循环系统调节等多种生物学过程。根据P≤0.05筛选出169个GO条目，在GO富集分析中，其中前30个差异基因的结果见图7。将获得的靶点导入KEGG数据库，在通路水平上全面揭示桃红四物汤的作用机制。最终得到了165条关键通路，根据P≤0.05筛选出前30条富集通路，见图8。通路上的所含基因产物（靶点）越多，桃红四物汤越有可能通过这些通路发挥作用，包括IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor，TNF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路、核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路等。这165条关键通路的生物学功能可以分为4个主要调节模块：促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增生、免疫调节、内分泌调节、血液循环系统调节。从主要的4个模块中筛选出关键通路的代表，分别为TNF通路、IL-17通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路（图9）。结果表明，AKT1、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulatedkinase，ERK）、IκB激酶β（inhibitor of NF-κB kinase β，IKKβ）等核心靶点在通路网络中起着关键作用。
将桃红四物汤筛选得到的核心靶点与其所对应的关键蛋白使用AutoDock软件进行分子对接验证，以直观的方式展示了关键成分的最佳构型和核心靶点之间的相互作用，对接结果如表2所示，分子与标靶蛋白的最低结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合，其中AKT1蛋白与咖啡酸、阿魏酸、山柰酚的对接结合能均小于−5 kJ/mol，结合能分别为−5.09、−6.17、−6.24 kJ/mol；IL-6蛋白与山柰酚结合能为−5.68 kJ/mol。主要活性成分和核心靶点之间的结合情况与预测关系相符。如图10-A所示，咖啡酸与AKT1的ARG-15和LYS-20残基的氢键连接；如图10-F所示，阿魏酸与IL-6的LYS41残基的氢键相对接；如图10-I所示，槲皮素与VEGFA的LYS-48残基的氢键对接。桃红四物汤中的主要活性成分与核心靶点的高结合亲和力表明，桃红四物汤可能是通过调节以上相关靶标发挥治疗作用。
3 结论与讨论
桃红四物汤在四物汤的基础上加用桃仁、红花2味药，增强了活血化瘀的功效，具有补血而不滞血、和血而不伤血的特点，临床用于血瘀证引起的诸多疾病。瘀血学说始见于《黄帝内经》，奠基于张仲景，瘀血既成后，又可作为病因影响人体气血和脏腑功能，引起疼痛、出血、经脉瘀塞不通、脏腑症结，以及“瘀血不去，新血不生”等诸多病理变化，为桃红四物汤在临床上异病同治奠定了理论基础。本研究通过成分、靶点匹配和分子对接，发现桃红四物汤中活性成分阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚、咖啡酸、芍药苷、藁本内酯能匹配到较多靶点，关键靶点分别与肿瘤细胞增殖与凋亡、免疫调节、内分泌调节、血液系统调节相关，主要涉及TNF、IL-17、MAPK、VEGF信号通路，预测得到桃红四物汤治疗的主要疾病主要为癌症相关疾病、心血管相关疾病、神经系统相关疾病。阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚、芍药苷、藁本内酯、咖啡酸能匹配到较多靶点，且常用于桃红四物汤的质量控制，阿魏酸、山柰酚、芍药苷分别为《中国药典》2015年版规定的当归和川芎、红花、白芍的含量测定指标。研究表明，阿魏酸是当归、川芎的共有成分，具有抗血栓、调脂、抗氧化、抗菌、抗炎作用[15]；山柰酚为红花、白芍的共有成分，能抗癌、抗氧化、抗炎、抗骨质疏松等[16-17]；槲皮素为红花、桃仁的共有成分，可抑制各种肿瘤细胞的增殖，与凋亡调节因子Bax和Bcl-2有关，能上调半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid protease，Caspase），下调NF-κB表达；芍药苷为白芍的主要有效成分，具有解痉镇痛、解热、抗炎、抗肿瘤等药理作用[18-19]；藁本内酯为川芎和当由此可见，这些成分可以作为桃红四物汤重要的有效成分，并用于该方剂的质量控制。基于活性化合物筛选得到的关键靶点可分为4类，分别与肿瘤细胞增殖与凋亡、免疫调节、内分泌调节、血液系统调节相关。抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡相关靶点蛋白为AKT1、ALB、JUN、myc原癌基因蛋白质（myc proto-oncogene protein，MYC）、Caspase-3蛋白酶（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等；免疫调节相关靶点为IL-6、IL-1β、IL-10等；内分泌调节相关靶点为ESR1、前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、受体酪氨酸蛋白激酶（receptortyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）、雄激素受体（androgen receptor，AR）等；血液系统调节相关靶点为VEGFA、HIF-1A、表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、前表皮子宫出血[26]等妇科疾病，可能均与内分泌调节有关；治疗冠心病、高[31]等疾病可能与免疫调节相关；治疗乳腺癌[32]可能与肿瘤细胞增殖与凋亡的靶点相关。从主要的4个模块中筛选出关键通路，分别为TNF信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路。（1）TNF信号通路调节着很多重要的生物学活动，如免疫反应、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤发生。研究发现TNF-α与其配体TNFR的相互作用参与了许多人类疾病的发生，如败血症、糖尿病、癌症、骨质疏松症和类风湿性关节炎等[33]。桃红四物汤有效成分可抑制TNF的表达，阻断TNF信号通路起到抗肿瘤的作用[34]。（2）IL-17是一个重要的促炎症细胞因子，其信号通路与免疫调节相关，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用[35]。大量临床研究也发现，桃红四物汤在治疗腰椎间盘突出[36]、改善全髋关节置换术后凝血功能及疼痛程度[37]等疾病时，可降低患者血清中炎症介质IL-17水平，其可作用于这些靶点提高免疫系统功能。（3）MAPK信号通路与炎症和肿瘤相关，该通路参与了细胞生长、发育、增殖、分化等多种生理、病理过程[38]。研究也发现，桃红四物汤通过调节MAPK信号通路抑制血管平滑肌的迁移和增殖[39]，联合化学药治疗哮喘[40]等。（4）VEGF是调节血管生成和血管新生的重要调节因子。分泌VEGF对于维持血管平衡稳定和存活起着十分重要的作用。生理状态下，血管生成过程被严格调控，只有在特殊情况下被激活，如伤口愈合过程；病理状态下，如癌症发生发展过程中，往往伴随着过度的血管生成，以提供更多营养供癌细胞生长。因此，现代治疗肿瘤的方法中，很重要的一个策略就是抑制肿瘤中血管生成[41]。研究发现，桃红四物汤活血化瘀治疗痛经、乳腺癌等疾病与VEGF信号通路有着密切的联系[42-44]。将匹配的关键靶点进行疾病关联，得到桃红四物汤治疗的主要疾病主要为癌症相关疾病、心血管相关疾病、神经系统相关疾病。（1）其中癌症相关疾病包括乳腺癌、前列腺癌等。乳腺癌属于中医“乳岩”范畴，瘀血内结是乳岩发生、发展的重要病机之一。中医认为血瘀与肿瘤互为因果，且贯穿肿瘤进展的始终；现代临床研究表明，中医辨证为瘀毒内阻型的乳腺癌术后患者45%发生血行转移[45]，大多数乳腺癌患者体内普遍存在着血液高凝状态。桃红四物汤能抑制乳腺癌患者肿瘤血管生成[46]，提高化疗疗效，改善患者临床症状及减轻毒副反应[47]，改善术后上肢肿胀[48-50]等并发症。本研究发现，桃红四物汤治疗乳腺癌的关键作用靶点（图4）主要包括激素调节相关靶点ESR1、ESR2、PGR、PTGS2，以及EGFR，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移密切相关。（2）心血管相关疾病包括高血压、心肌梗死、心脏衰竭等，均是血瘀证的常见疾病。临床研究表明桃红四物汤联合苯磺酸氨氯地平片治疗老年高血压，可更有效地将血压控制在正常值之内，进而降低脏器损害，避免并发症[51]；桃红四物汤合真武汤联合化学药，治疗阳虚血瘀型慢性射血分数降低性心力衰竭患者具有良好的临床效果，改善患者心功能[52]。本研究发现，桃红四物汤治疗心血管相关疾病作用的关键靶点（图4）主要包括血管新生相关靶点VEGFA；激素调节相关靶点肾上腺素（ADRB1、ADRB2、ADRA2A、ADRA1D）、前列腺素（PTGS2、PTGIS）、雌激素（ESR1）。（3）本研究预测出桃红四物汤可用于神经系统相关疾病如阿尔茨海默病的治疗。阿尔茨海默病是一种不可治愈的神经退行性脑病，淀粉样斑块是其主要病理特征和临床诊断指标；中医认为淀粉样斑块沉积是“浊毒”的一个方面，可以被认为是中医的“脑络受损”范畴[53]。但网络药理学研究过程中没有考虑成分血脑屏障的参数（lgBBB），故其作用需要进一步探索。
本研究通过网络药理学和分子对接，构建了其主要有效成分、作用靶点和通路、治疗疾病的复杂网络，一定程度上揭示了桃红四物汤活血化瘀功效在临床上异病同治的作用网络，为桃红四物汤的实验研究和临床应用提供了理论依据。然而筛选得到的成分只是考虑其活性和入血情况，并未衡量其在复方中的含量等问题，且只通过分子对接对主要成分和关键靶点进行了验证。在此基础上，可进一步通过体内、外实验来验证成分和靶点之间的作用关系，深入揭示桃红四物汤的药效物质基础和作用机制，用现代科学语言诠释传统经典名方的科学内涵。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：邓晶晶，江华娟，兰 兴，李敏敏，王升菊，何 瑶．基于网络药理学和分子对接探究经典名方桃红四物汤异病同治作用机制 [J]. 中草药, 2021, 52(10): 3018-3029 .
