腺病毒包装纯化及感染实验操作步骤

技术背景

Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。

所需试剂

1.293 细胞；

2. 重组好的腺病毒质粒；

3. Pac I 限制性内切酶；

4. 质粒回收相关试剂；

5. 细胞培养、转染相关试剂；

6. TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl，pH8.1；

7. 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；

8. 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；

9. Beckman 离心管：14*89 mm，SW41 转头；

10. Polybrene (sigma)，10 mg/ml；

11. 透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），MW=8000~14400；

12. 灭菌甘油。

操作流程

1.293 细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种于1 或2 个60 mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；

2. 在转染前，用Pac I 处理目的质粒（一般一个60 mm 细胞盘需要6μg DNA）。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 μl 无菌水中；

3. 用PEI 或其他转染试剂将6 μg Pac I 处理过的质粒转染细胞；

4. 8 个小时后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培养液（10% CBS，1%Pen/Strep）；

5. 在转染后7 到10 天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融，可保存于-20℃；

6. 将293 细胞以50-70%的汇合率铺于60 mm 培养盘中，以30-50%的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明显的细胞裂解或CPE 现象；

7. 在有1/3 到1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后3-5 天收集病毒。可进一步通过Western blot 或PCR（5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1 小时，然后煮沸样品5 min，离心后取1-2 μl 进行PCR 反应）证实重组腺病毒的存在；  8. 按步骤5 的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107 infectiousparticles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；

9. 为了进一步扩增，将步骤8 获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细胞，按步骤5 的方法收集病毒，并进而将其感染150 mm 细胞培养盘中的293细胞，以获得足够量的病毒；

10. 将15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液；

11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上；

12. 超速离心，30000 rpm，4 度离心16 个小时；

13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16 号针头将这一条带收集；

14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小时；

15. 将纯化的腺病毒分装于EP 管中；

16. 在Eppendorf Biophotometer 中测量透析液中的总蛋白量，1μg 病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒；

17. 长期保存于-70 度中，短期可保存于4 度，切忌反复冻溶；

18. 由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，10：1，100：1，1000：1 的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：1000 的Polybrene。在37 度下平板离心30 分钟；

19. 感染8~12 小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中，加入适量全培液。