编译：思越，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
鼻咽癌（NPC）是一种侵袭性恶性肿瘤，种族和地理分布极为不均。鼻咽癌中存在非常复杂的肿瘤微环境(TME)，靶向TME在NPC中标志着一种有前途的治疗方法。本研究首次从单细胞水平上系统全面地构建了鼻咽癌的肿瘤微环境图谱，鉴定了多种免疫细胞亚群，对鼻咽癌肿瘤细胞的异质性和免疫细胞的多样性进行了深入分析，鉴定了一系列与患者预后密切相关的分子特征及潜在的治疗靶点。该研究在单细胞水平上揭示了鼻咽癌的细胞异质性，为鼻咽癌的精准治疗奠定了新的基础。原名：Single-cell transcriptomics reveals regulators underlying immune cell diversity and immune subtypes associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma译名：单细胞转录组学揭示了与鼻咽癌预后相关的免疫细胞多样性和免疫亚群的潜在调控因子DOI号：10.1038/s41422-020-0374-x通过收集了15例初治鼻咽癌患者的原发性肿瘤样本，1例慢性鼻咽炎患者的正常鼻咽上皮组织样本进行单细胞转录组测序（图1a）获得了48,584个单细胞数据，并对其中的12例肿瘤进行了全外显子组测序和RNA-seq分析。共注释出免疫细胞(髓样细胞、T/NK细胞、B细胞)和癌症相关成纤维细胞(CAF)以及上皮中的恶性及非恶性细胞（图1b）。作者在上皮细胞中推断染色体拷贝数变异（CNVs），最终作者从11个肿瘤样本中发现了7581个恶性细胞，恶性细胞中存在大规模的染色体扩增和缺失，用以区分恶性与非恶性细胞（图1c）进行进一步分析。通过对每种细胞类型中进行归一化、降维和聚类，最终建立一个包含13个恶性细胞亚群和23个不同的免疫细胞亚群鼻咽癌肿瘤微环境图谱（图1d，e）。
对11名患者的7581个恶性肿瘤细胞聚类后呈现高度的肿瘤间异质性（图2a），且对这些细胞从不同维度进行了恶性评分（图2d）；有超过700个基因在肿瘤内特异性表达（图2b），且在不同的肿瘤通路中富集。通过对恶性细胞进行非负矩阵分析(NMF)，确定了44个与恶性细胞亚群共表达的元基因，并聚类成5个瘤内异质性恶性基因表达特征（图2c）。三个上皮分化相关特征主要由上皮基因组成，例如细胞角蛋白（例如KRT6）和富含脯氨酸的蛋白（例如SPRR2和SPRR3）。第四个特征与细胞循环有关，由细胞循环相关基因组成，最后一个特征富集与细胞分泌相关的基因（图2d）。接着作者基于基因表达数据，使用2个独立队列探究特征基因集与临床病理特征的关系。发现介导病毒进入宿主细胞的基因（如TMPRSS2、 PVRL4、 CTSB 和 SLC20A2）与 epi-differ2基因集高度相关，且EBV阳性肿瘤具有更高的epi-differ2得分（图2e），表明Epi-differ 2可能与EB病毒感染鼻咽癌上皮细胞的进程密切相关。cell secretion基因集与间质浸润性淋巴细胞(TILs)正相关，可能促进了鼻咽癌肿瘤微环境中淋巴细胞的增加，而瘤内浸润性淋巴细胞与cell cycling基因集的负相关提示可能存在肿瘤-免疫相互作用（图2f），生存分析显示cell cycling基因集高表达的病人具有更差的预后（图2g,h），提示cell cycling基因集可以预测鼻咽癌细胞的侵袭性。
作者将5191个髓系细胞最终聚集成6个亚群(图3a) ：巨噬细胞、单核细胞、 pDCs、 CLEC9A + DC (DC1)、 CD1C + DC (DC2)和 CCR7 + DCs (DC3)(图3b)。其中，DC1构成主要的树突状细胞亚群，并表达了 CLEC9A、IRF8和 IDO1等1型树突状细胞标志物，在抗肿瘤免疫中起到重要作用；DC3表达了CCR7、LAMP3、FSCN1和CCL19等与树突状细胞激活相关的标志物；DC2表达了常规2型树突状细胞的经典标记基因；pDC中高度表达了编码促凋亡酶颗粒酶B的GZMB(图3c)，可能该亚群细胞表现出GZMB依赖性细胞毒性。作者通过比较不同髓系细胞亚群的通路活性来表征功能差异。参与干扰素（IFN）-α和IFN-γ反应的通路在巨噬细胞中上调，而血管生成，NF-κB介导的TNF-α信号传导和缺氧相关通路在单核细胞中被上调（图3d）。这些结果表明鼻咽癌中单核细胞具有潜在的促肿瘤特征，与S100A8和S100A9的高表达相一致（图3c）。接着作者应用SCENIC分析确定了在NPC中不同髓样细胞亚群的TF（图3e）。有趣的是，巨噬细胞和单核细胞在许多转录因子上具有相似的表达模式（图3e），表明巨噬细胞可能源自鼻咽癌肿瘤微环境中的单核细胞。此外，单核细胞中BACH1和 RUNX1调节的基因显著上调，巨噬细胞中NR1H3和TFEC调节的基因上调明显（图3e），并通过siRNA干扰技术发现NR1H3和TFEC促进单核细胞衍生的巨噬细胞的分化和成熟，表明这些调控因子可能促进NPC的抗肿瘤免疫力(图3J，m)，进一步的生存分析揭示了NR1H3和TFEC的高表达水平与NPC患者预后改善之间存在关联（图3k，n）
4 T/NK 细胞亚群转录因子调节鼻咽癌抗肿瘤免疫反应T/NK细胞(n = 17,741)是鼻咽癌中最常见的细胞类型，可划分为10个亚群（图4a，b）。作者比较了不同亚群间T细胞功能相关基因的表达情况，CD8+T-1、CD8+T-2和CD8+T-3亚群中，细胞因子和效应分子在CD8+T-1高表达，表明CD8+ T-1亚群代表鼻咽癌细胞毒性的主要亚群；CD4 + Tconv-2代表幼稚的T细胞，而耗竭性标记基因如PDCD1和TIGIT在CD4+ Tconv-3中高度表达（图4c），通过轨迹推断CD4+ T细胞起始于CD4 + Tconv-2细胞，并分叉成CD8+T-1和CD8+T-3细胞(图4d，e)；CD8+细胞的分化轨迹也出现分支，起始于CD8+T-3和CD8+T-2细胞，并分化为细胞毒性/激活谱系细胞或功能障碍谱系细胞(图4f，g)，且功能障碍细胞的免疫检查点分子CTLA4、 LAG-3和HAVCR2高表达(图4c，h)。作者发现耗竭性的标记基因与细胞毒性标记物的表达高度相关（图4c），这是因为LAG3和HAVCR2与T细胞活性相关，并通过颗粒酶（GZMA，GZMB和GZMH）的平均表达进行定量（图4h）。这些结果反映了鼻咽癌中依赖激活的耗竭表达程序，LAG3和HAVCR2在鼻咽癌中或可作为比PDCD1更为有效的免疫治疗靶点。接着作者使用SCENIC分析各亚群中的显著转录因子，NFATC1被认为是CD4+ Tconv-3的潜在转录因子，调节T细胞活化后PD-1的表达；NK细胞中与CD8+ T细胞的部分细胞毒性TF（EOMES，RUNX3和XBP1）显著上调（图4i），说明这些转录因子在鼻咽癌中对CD8+ T细胞和 NK 细胞的细胞毒性具有潜在的调节作用，并通过siRNA干扰技术对验证结果（图4j–l）。总之，这些转录因子增强了CD8+ T和NK细胞在鼻咽癌中的细胞毒性。
作者通过CellPhoneDB对配体—受体之间以及主要细胞类型之间的分子相互作用进行预测，发现在免疫细胞和肿瘤细胞间的广泛互作（图5a，b）。肿瘤细胞表达较高水平的趋化因子（如CCL20，CCL19，CXCL10），而相应的受体在免疫细胞中广泛表达，表明这些趋化因子在增强免疫细胞向NPC肿瘤组织的浸润中起重要作用（图5c）。此外，肿瘤细胞与 t 细胞之间的抑制性相互作用十分普遍，除CD274-PDCD1外，还鉴定了如NECTIN1-CD96，NECTIN2-TIGIT，PVR-CD96和LGALS9-HAVCR2等在鼻咽癌中较少报道的受体-配体对（图5c，d）。作者还确定了肿瘤细胞与巨噬细胞之间的配受对，例如CD47–SIRPA和CSF1–CSF1R产生的抑制性或刺激性相互作用（图5c，e）。此外，作者鉴定出了特定的配体-受体复合物，这些复合物可调控多种免疫细胞亚型协调的免疫调控途径（图5d-f）。在巨噬细胞，DC1，DC2和DC3中，尤其是在巨噬细胞和DC3中，检测到趋化因子高表达，表明它们在募集各种类型的免疫细胞中起重要作用（图5f）。有趣的是，DC3和T细胞之间的抑制性交流也很普遍（图5f），而DC1表达的 XCR1水平相对较高，XCR1配体在NK 细胞中大量表达(图5f) ，提示 NK 细胞与 DC1之间存在功能上的相互作用。
作者探究了来自23个免疫细胞亚型的17个亚型特征基因集与鼻咽癌患者的临床病理特征的关系。5种特征基因集（pDC，DC1，NK细胞及FCRL4 +和血浆B细胞）与EBV感染相关，在EBV阳性肿瘤中的得分均低于EBV阴性肿瘤（图7a）。进一步探讨了其与血浆EBV DNA水平的关系，发现CLEC9A + DC1与EBV DNA水平呈显着负相关，表明DC1可能受EBV主动复制的影响（图7b），DC1，FCRL4+ B，GCB和浆细胞与较高数量的突变显着相关，但是大多数免疫细胞亚型通常与突变负荷相关性较弱（图7c）。作者最后探讨了这些免疫特征在预测鼻咽癌中的作用。在鼻咽癌队列A中，巨噬细胞、PDCs、DC1、NK细胞和浆细胞的特征与生存之间存在显著的正相关，并在队列B中验证其作为预后标志物的可靠性。
图6 鼻咽癌免疫亚型特异性基因集与临床病理特征及生存的关系本文从15例原发性鼻咽癌肿瘤（NPC）和1个正常样品中捕获了7581个恶性细胞和40,285个免疫细胞的单细胞转录组谱，揭示了肿瘤内的转录异质性并预测了恶性细胞的侵袭性，并揭示了免疫细胞潜在的转录调控因子及细胞间相互作用，为鼻咽癌的精确疗法奠定了新的基础。此外，作者建立了免疫细胞亚型特异性的转录组特征，并证明巨噬细胞，浆细胞样树突状细胞（pDC），CLEC9A + DC，自然杀伤（NK）细胞和浆细胞与NPC生存改善显着相关。本研究为鼻咽癌肿瘤微环境的细胞异质性提供深入的见解，并突出了抗癌治疗和风险分层的潜在生物标志物，为鼻咽癌的精确疗法奠定了新的基础。
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