科研 | Cell：单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化
肺癌是导致癌症患者死亡的主要原因，它表现出的异质性使其具有适应性，限制了治疗的成功，且仍没有被完全了解。本研究采用30名转移性肺癌患者在靶向治疗前和治疗期间的49份临床活检进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。20000多个肿瘤微环境(TME)单细胞图谱显示了一个丰富而动态的肿瘤生态系统。肿瘤细胞scRNA-seq检测的靶癌基因超出了临床检测到的。作为残留疾病(RD)治疗后存活的癌细胞表达肺泡再生细胞信号，提示治疗诱导了细胞状态的原始转变，而在治疗引发的进展性疾病(PD)中出现的细胞则上调了犬尿氨酸、血纤维蛋白溶酶原和间隙连接通路。RD表现为T淋巴细胞活跃和巨噬细胞减少，PD表现为免疫抑制的细胞状态。scRNA-seq揭示的生物学特征是临床结果的生物标记，强调了治疗是如何诱导转移性癌的多细胞生态系统而形成临床结果。
论文ID
原名：Therapy-Induced Evolution of Human Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing
译名：单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2020年9月
通讯作者：Collin M. Blakely & Spyros Darmanis & Trever G. Bivona
通讯作者单位：UCSF医学院 & 陈.扎克伯格生物中心
DOI号：10.1016/j.cell.2020.07.017
实验设计
结果
研究使用scRNA-seq测定49个样本(45个肺腺癌，鳞状细胞癌1例，癌旁组织3例[TATs])(图1A)，对应30个患者。使用特定工作流程从小的组织样本和手术切除部位中分离出可行的单细胞(图1B)。样本被分为三个独立的时间点(TN, RD或PD)，并根据致癌驱动因素进一步细分(图1C)。图S1A中举例说明RD样本的采集时间。表S1中包含了更多的样本细节和患者人口统计信息。
经质控筛选后共保留23261个细胞的基因表达谱。基因表达归一化之后，进行了主成分分析(PCA)，并在PCA空间上基于图形的聚类对细胞进行聚类分析(n = 20)。由此产生的细胞簇被标记为免疫细胞、基质细胞(成纤维细胞、内皮细胞和黑素细胞)或上皮细胞(图1D)。上皮细胞(n = 5,581)被切除并重新聚集成26个离散的上皮细胞簇(图S1B)。每种类型的细胞数和每个样品用于分析的详细情况见表S1。
图1 患者特点及实验概述。
2 基于聚类的拷贝数变异解决非癌性上皮细胞的癌症
考虑到癌症和大量染色体改变之间的联系，研究利用RNA表达的拷贝数变异(CNV)将上皮细胞分为癌症和非癌症；与成纤维细胞和内皮细胞(对照)相比，癌细胞在整个基因组中表现出更大的相对表达强度变化(图S1C)。此分析包括三份TAT样本，来源于这些样本的大部分细胞被归类为非癌性细胞(表S1)。研究比较不同治疗时间点之间样本(TN, RD, PD)的平均CNV评分，结果一致。非癌症上皮细胞簇(n = 16)被进一步注释为细胞亚型(图S1D和S1E)。
正如其他人所指出的，研究发现癌细胞表达的独特基因数量比非癌细胞高(图S1F)。唯一表达基因数量的差异不能用测序深度来解释(Pearson相关性系数为0.19)。
49个原始肿瘤活检样本中有44个发现了癌细胞，包括小部分来自于TAT样本的细胞(占TAT获得细胞总数的0.57%-1.8%)。鉴于TAT细胞可能代表了正常细胞和癌细胞之间的一种中间细胞状态，它们出现频率低。
将所有癌细胞(n = 3754)重新聚类，形成25个独特的簇(图S2A和S2B)。研究计算了每一个聚类簇中非癌症和癌症上皮细胞群中贡献最大的单个患者的细胞数(患者占有率)(图S2C-S2E)。大多数肿瘤细胞簇是源于患者，有很高的患者占有率，结果类似于之前的报告。相反，非癌细胞类型表现出较低的患者占有率(图S2E)。因此，针对特定患者的恶性细胞聚类反映了个别患者肿瘤的独特分子特征。
3 scRNA-seq分析揭示了癌细胞表达基因改变的复杂性
基因改变可以与主要的靶向性致癌“驱动”改变共存(如致癌基因EGFR、ALK、KRAS)，也可能有助于促进肿瘤进展和限制治疗。研究分析了每个癌细胞的scRNA-seq转录本以识别体细胞的变化(图2A-2C；图S2G-S2I)。49个活检样本中有44个样本含有癌细胞，鉴定出20个样本含有临床已知的致癌驱动因子(图2B；表S3)。所占百分比与scRNA-seq分析中可能出现的占有率一致。在没有识别出临床上已知的致癌驱动基因的24个样本中，没有细胞表达这些基因，因此不允许对这些基因进行突变检测(图S2H；表S3)。在20个样本的11个样本(55%)中确定了临床致癌基因，还确定了在同一患者肿瘤的临床级批量核酸检测中未检测到的另一种致癌基因改变(即隐匿性基因改变)(图2B；图S2H)。LTS47就是一个例子。经临床级DNA分析，该肿瘤中存在EML4-ALK致癌基因重排。另外，scRNA-seq还显示，该样本含有KRAS G13D和KRAS G12C隐匿突变的癌细胞(图S2F)。考虑到scRNA-seq数据中可能存在的遗漏，研究人员不能断定ALK融合和KRAS突变是否共存于同一细胞内。然而，KRAS突变体细胞中没有显示ALK基因重排的迹象。该样本是在经过多种治疗后从患者身上获得的，这可能会导致多种耐药机制的进化。致癌驱动基因的缺失也是一种耐药机制，但考虑到scRNA-seq的局限性，我们不能确定这种耐药机制是否适用于本案例。
研究人员还查询了COSMIC(癌症体细胞突变目录)中肺腺癌第1级突变的突变数据(表S2)。尽管发现的许多突变已经包括在临床小组中，但在对病人肿瘤进行的临床分析中并没有报道过(图2C；图S2I；表S2和S3)。虽然这可能反映了临床检测时活检技术或肿瘤克隆性的差异，但这些结果也表明临床级批量DNA检测可能低估了肿瘤的异质性。
为了评估存在多种致癌改变的患者的临床结果，并确定本研究的研究结果更广泛的转化影响，使用了NSCLC数据库的MSC-Impact。那些在scRNA-seq图谱中检测到的1级COSMIC集中有大于或等于2个突变的患者(高突变)与那些肿瘤中有小于2个COSMIC 1级突变(低突变)的患者相比，其总体生存率(OS)显著降低(p <0.01；图S2J)。因此，scRNA-seq分析可以增加对癌细胞基因组异质性的分析力度，并洞察转录突变的情况。
图2 scRNA-seq可以推断患者的突变状态，并揭示癌细胞中复杂的突变情况。
4 TN和RD癌细胞的转录差异揭示了细胞状态特异性的生物学过程
研究假设，在治疗期间癌细胞中激活的生物过程可以识别在初始治疗期间(包括RD)促进癌细胞适应和生存的信号通路。比较了从TN到RD的肿瘤样本中获得的单个癌细胞的转录本(表S4)，并着重关注了RD癌细胞中629个上调的基因，可作为通路激活的替代证据，发现了许多与癌症相关途径相关的基因(表S5)。重要的是，研究还发现，与TN和PD相比，RD癌细胞表达的增殖标记基因减少，这与预期一致，即在靶向治疗期间，持续存在的癌细胞通常增殖较少(图S3A)。
有趣的是，研究鉴定了一个由17个已建立的肺泡细胞基因标记组成的肺泡细胞基因表达特征，在RD和TN时间点上其表达显著增加(图3A；图S3B；表S2)。肺泡细胞由肺泡1型(AT1)和肺泡2型(AT2)亚型组成，构成肺泡的内衬。AT2细胞产生表面活性剂，可作为干细胞样祖细胞，在各种类型的肺损伤中变得活跃并增殖，被怀疑是癌基因驱动的肺癌的细胞来源。AT1细胞是肺泡中的优势细胞群，介导气体交换，在受伤或死亡时，可释放增殖和再生信号。AT1细胞包括HOPX+/IGFBP2+和HOPX+/IGFBP2-两种亚型，后者代表维持细胞可塑性的细胞群，可增殖并转化为AT2细胞，使损伤后组织再生。在RD癌细胞中检测到的肺泡特征包括AT1和AT2相关基因(表S2)，包括AT2细胞的AQP4、SFTPB/C/D、CLDN18、FOXA2、NKX2-1和PGC，AT1细胞的AGER、HOPX和IGFBP2(图S3B)。此外，研究在癌细胞中鉴定的肺泡细胞状态并不是来自我们的癌细胞群中注释错误的非癌症肺泡细胞(图S3C)。
研究用正交方法验证RD时肺泡细胞特征的激活。首先，使用由患者衍生的EGFR突变NSCLCs (PC9)组成的临床前模型开发TN、RD和PD临床状态的类似物。通过RT-PCR，检测了RD临床样本中显著上调的肺泡细胞标志基因NKX2-1的表达，发现与对照和获得性耐药状态细胞相比，在维持状态细胞中NKX2-1的表达显著升高(图3B)。这表明从临床scRNA-seq分析中识别的肺泡特征可以在体外受控条件下复制。此外，免疫组化(IHC)分析显示，与TN和PD临床样本相比，RD临床样本的质膜上可诱导AQP4蛋白表达，AQP4是肺泡细胞特征的另一标志物(图3C；图S3D)。
在TCGA肺腺癌组织RNA-seq数据集中，测试肺泡特征是否为患者生存的临床相关生物标志物，发现，与肿瘤表现出较低表达的肺泡特征的患者相比，这些肿瘤的肺泡特征高表达与患者OS改善之间存在显著相关性(图3D；表S6)。
这些发现支持了RD癌细胞有明显的肺泡基因表达特征的论断，并与改善患者生存率相关。一个可能的模型是，RD癌细胞激活的肺泡特征反映了细胞损伤和修复特征，使人联想到非癌症的AT1和AT2细胞。这一特征的表达增加可导致治疗期间细胞死亡的修复和逃避，以支持癌细胞的持久性，同时构成一个较低的侵略性恶性状态。这与RD代表了一种在临床前模型中观察到存活但不快速增殖的缓慢循环癌细胞的永久细胞状态的观点是一致的(如图S3A所示)，它是绝对耐药性引发侵袭性肿瘤进展的前导。
肺泡的分子特征和细胞损伤修复的特征是值得关注的。在本研究的RD中，WNT/β-catenin相关通路基因SUSD2和CAV1表达增加(表S5)。研究使用IHC分析SUSD2和CTNNB1 (β-catenin)蛋白表达(图S3E和S3F)来验证观察到的转录变化。与本研究的scRNA-seq结果一致，与TN和PD相比，RD状态中膜SUSD2和核CTNNB1 (β-catenin)显著增加。此外，在两个临床试验(奥希替尼: NCT03433469或克唑替尼: NCT03088930)中，从EGFR(AZ)或ROS1(NC)接受新辅助TKI治疗的患者中获得的成对TN和RD样本中，CTNNB1核定位的比较如图S3G所示。SUSD2是WNT通路激活的下游靶点，而CAV1可促进β-catenin (CTNNB1)的核定位和WNT/β-catenin通路的转录激活。在NSCLCs中，WNT/β-catenin信号通路有助于细胞损伤后的肿瘤发生、修复和再生。AT2细胞的自我更新和损伤反应特异性依赖于WNT/β-catenin信号通路。此外，在EGFR突变的NSCLC中，WNT/β-catenin通路的激活可能限制EGFR抑制剂的反应，并可能在体外EGFR抑制剂治疗期间促进永久细胞群的存活。总的来说，RD状态以细胞损伤和存活信号为特征，这些信号部分通过WNT/β-catenin通路发挥作用，可能具有治疗靶向性。
临床数据表明，在原发性EGFR或ALK靶向治疗中，WNT/β-catenin激活在治疗早期参与促进RD和耐药细胞的发展。为了进一步探索WNT通路研究结果的治疗潜力，研究使用患者来源的PC9细胞作为EGFR突变的NSCLC模型，使用H3122细胞作为ALK融合驱动的NSCLC模型。研究测试了这一假设，即预先阻断WNT/β-catenin信号通路以及致癌EGFR或ALK，这将减少在初始治疗中存活的细胞数量，并在治疗开始时增加反应强度。亲代细胞分别用EGFR或ALK TKI (奥希替尼或艾乐替尼)的IC50(导致细胞数量减少50%的抑制剂浓度)剂量处理。两种不同的WNT/β-catenin通路抑制剂XAV939和PRI-724用四种先前报道的浓度或联合治疗进行测试。体外实验结果支持了本研究的假设，证明前期抑制WNT/β-catenin通路与同源TKI结合导致明显的细胞融合且剂量依赖下降和反应强度增加(图3G-3J；图S3H-S3O)。
5 通过scRNA-seq分析TN和PD之间的转录差异揭示了免疫调节和细胞侵袭是癌症进展的关键特征
接下来本研究讨论了靶向治疗期间TME的演变。免疫细胞(n = 13431)被聚类并注释(图4A；表S1和S4)。与肿瘤细胞聚类(主要是患者特异性的)相比(图S2C和S2D)，免疫细胞类型聚类显示了较低的患者占有率(图4B)。这与在患者和样本中在比较TN和PD样本的癌细胞时，研究发现PD癌细胞中有901个差异基因上调(表S4)。在这些基因中，确定了参与犬尿氨酸通路的基因以及与肿瘤发生和炎症相关的多个基因和通路(表S5)。
研究观察到在PD和TN癌细胞中，参与犬尿氨酸通路的IDO1、KYNU和QPRT基因表达增加(图3K；图S3P；表S2)这些基因的表达可导致免疫抑制行为，说明PD肿瘤内的癌细胞可能直接抑制免疫系统的活性。该通路介导PD肿瘤的免疫抑制，识别该通路具有重要的潜在治疗意义，因为IDO1在许多癌症中上调。多项临床试验试图使用IDO1抑制剂作为单一疗法以及与免疫检查点抑制剂或激素疗法联合使用来阻断这一通路，尽管成功程度有限。在使用PC9细胞的体外模型中，QPRT在获得性EGFR抑制剂治疗(即类似于临床PD)时也表现出表达增加(图3L)，强化了该通路在治疗的选择性压力下癌症发展的断言。为了进一步证明犬尿氨酸通路的临床相关性，我们再次使用TCGA肺腺癌RNA-seq数据集。肿瘤中此标志物高表达，是患者OS较差的生物标志物(图3M；表S6)。这与此途径的激活导致免疫抑制和免疫系统无法有效地监视和根除癌细胞的观点相一致。
6 从RD到PD，癌细胞的scRNA-seq谱发生变化
研究比较了RD患者和PD患者样本的癌细胞，以阐明在RD导致PD的过程中发生的差异，并发现在RD或PD中总共有2182个基因表达显著升高(NRD = 1121，NPD = 1061)(表S4)。RD的差异过表达基因是与肺泡细胞特征、细胞生长、分化、细胞运动和肿瘤抑制相关的基因(表S5)。RD癌细胞过表达表面活性基因(SFTPB/C/D和SFTA3)，这是肺泡细胞特征的一部分(图3A；图S3B)。此外，NKX2-1和NFIX在RD癌细胞中过表达，并与细胞活性下降相关。NKX2-1的低表达导致分化的丧失和肿瘤播种能力的增强。这一研究和之前RD癌症细胞分析的共同结果表明，细胞的损伤-修复和再生状态可能促进癌症细胞的惰性，增加肿瘤控制和改善临床结果。
相反，PD肿瘤细胞的过表达与侵袭、细胞间互作、分化及免疫调节的基因相关(表S5)。纤溶酶原激活途径中的几个基因(ANXA2, PLAT, PLAUR, PLAU)(图3N)及纤溶酶原抑制基因SERPINE1 (PAI1)明显过表达(图3O；图S3Q)。ANXA2和PLAUR是纤溶酶原活化级联中的受体蛋白，通过降解细胞外基质参与炎症、血管生成、侵袭和转移。ANXA2或PLAU分别与PLAT (uTa)或PLAU (uPa)结合时启动信号传导。然后，纤溶酶原通过PLAT和/或PLAU的活性降解为纤溶酶，导致金属蛋白酶的激活和纤维蛋白的降解。SERPINE1在许多癌症亚型中表达增加，并在细胞粘附、侵袭、肿瘤血管化、放射抵抗和免疫抑制中发挥重要作用。在TCGA肺腺癌RNA-seq数据集中，纤溶酶原激活信号的高表达与患者OS的恶化有关(图3P；表S6)。同样，在这个独立数据集中，SERPINE1的高表达与较差的OS相关(图3Q；表S6)。EGFR抑制剂治疗可以诱导SERPINE1和EGFR突变体的表达，在EGFR抑制剂治疗期间SERPINE1 (PAI1)血浆水平超过2倍的患者证明其生存期较短。总的来说，本研究的scRNA-seq分析阐明了纤溶酶原活化级联在临床预后不良和靶向治疗耐药中的临床相关性和潜在作用。
此外，本研究发现与RD肿瘤细胞相比，PD肿瘤细胞中有几种间隙连接蛋白过表达(图3R；表S2)。间隙连接蛋白是一种完整的膜蛋白，允许细胞间的离子、代谢物和次级信使在胞内交换。一些蛋白已被鉴定为肿瘤抑制因子，但研究发现TCGA肺腺癌RNA-seq数据集中GJB2/3/5高表达(图S3R；表S6)与较差的生存率有关(图3S)。这些结果表明，不仅在本研究数据分析中，而且在NSCLC中也普遍存在促肿瘤效应。
在癌细胞中，研究发现了一个临床相关的复杂性，表达突变可能影响治疗反应。此外，对不同治疗时间点的单个癌细胞的转录谱进行评估，确定了几种临床相关的细胞状态变化(图S4A)。研究发现，癌基因驱动突变的类型(EGFR或ALK)(图S4B-S4K)和活检部位(原发或转移)所确定的治疗时间点特征大多持续存在。虽然我们发现这些癌细胞的特征是强大的，但必须承认样本之间存在患者异质性(图S4L-S4O)。
图3 不同处理时间点之间的基因表达差异分析，揭示了处理阶段的特异性转录特征。
7 个别病人在治疗期间肿瘤的纵向scRNA-seq分析
由于大多数肿瘤在TKI治疗期间会有50%或以上的退化率(尽管不完全)，因此在治疗前和治疗期间对晚期肺癌患者进行连续的临床肿瘤活检是有挑战性的。然而，从一名患者(TH226)的同一原发肿瘤的3个治疗时间点获得了样本，该患者的肿瘤包含标准的EGFR 19外显子缺失致癌突变，并使用EGFR抑制剂奥希替尼进行治疗(图S5A-S5C)。在3个活检中，研究通过癌细胞中EGFR 19外显子驱动突变和其他几个突变的scRNA-seq RNA表达进行鉴定(图S5D)。
当将TH226与其余的scRNA-seq数据集进行比较时，发现了重叠的差异表达基因和特征(表S4；图S5E-S5H)。有趣的是，还发现与鳞状细胞分化相关的许多基因(KRT16、KRT14、KRT6A、KRT5、CLCA2、PKP1、ANXA8、DSG3)，在PD时比TN和RD时过表达(图S5I；表S4和表S5)。因为病人在腹膜透析时的肺肿瘤活检显示，从之前的活检显示的纯腺癌组织学转变为鳞状细胞癌(图S5C)。鳞状细胞癌的组织学转变是EGFR突变的NSCLCs对EGFR抑制剂耐药的机制之一。因此，scRNA-seq能够提供高分辨率、基因和通路的水平，以了解癌症药物治疗过程中产生的生物学和组织学可塑性。
8 PD与RD相比，TME内骨髓和淋巴样浸润倒转
发现常见免疫细胞表型的期望一致。比较了所有3个时间点的免疫细胞组成，表示为部分免疫细胞丰度载体之间的相关性。RD内的免疫组成与其他两种处理状态的差异最大(图S6A)。在所有的治疗时间点，T细胞和巨噬细胞都是优势细胞群，并在肿瘤反应和耐药过程中表现出相对丰度倒置，进一步研究了这一发现，如下所述(图4C)。与TN或PD样本相比，在RD时TME中T细胞占所有免疫细胞的更大比例(TN为27%，RD为46%，PD为31%)。巨噬细胞浸润呈相反的模式，与TN和PD相比，RD时巨噬细胞减少(TN为37%，RD为21%，PD为37%)。
在2例患者中，研究检查了在不同治疗时间点获得的匹配肿瘤活检的免疫细胞(TH226和TH266，分别图S6B和S6C)。在对TH266患者进行的2次肿瘤活检中，巨噬细胞和T细胞均显示巨噬细胞的比例降低，而T细胞从TN到RD的比例增加，结果与整个数据集相匹配(图S6D)。TH226表现出与治疗初期RD时巨噬细胞比例减少，PD时再次增加的模式相似(图S6E)。使用免疫荧光染色对组织样本进行了验证(图4D-4F；图S6F)。此外，将NSCLCs的TCGA大容量转录组数据分解为部分免疫细胞类型，发现含有高比例巨噬细胞的TCGA样本，其OS明显更差(图S6G)。这支持了研究观察到的临床相关性，并与之前的报道相一致，在手术切除早期NSCLCs的患者中巨噬细胞浸润与不良预后相关，以及EGFR TKI治疗期间生存率更差。
这些发现特别有趣，因为它们与PD-1抑制剂治疗的黑色素瘤相似，尽管在肺癌的蛋白靶向治疗的独特背景下。具体来说，在PD-1抑制期间，研究观察到黑色素瘤中CD8+ T细胞和自然杀伤(NK)细胞数量的增加和M1巨噬细胞数量的减少。在不同的肿瘤组织和治疗过程中，NK/T细胞和巨噬细胞可能有共同的反应。因此，可能存在针对不同癌症亚型和治疗方式的靶向RD的保守方法，这是未来研究的一个领域。
图4 每个肿瘤的肿瘤微环境在组成上的变化。
9 表达IDO1的巨噬细胞在PD时富集
从肺肿瘤活检中获得的巨噬细胞(n = 1,379)被分成5个不同的组(图S7A)，每个组的基因差异表达(图S7B；表S4)。此外，研究人员计算了5个巨噬细胞簇中来自3个治疗组的细胞比例(图5A)。
MF0在TN细胞中轻度富集，其特征是与免疫抑制表型相关的基因(C1QC、GPNMB、APOE、TREM2、FOLR2)的表达(图5B；图S7B)。MF1和MF3在RD位点富集。巨噬细胞簇表达MF1与肿瘤浸润骨髓源抑制细胞(FCN1、VCAN、S100A8、S100A9)以及THBS1和PTX3相关的特征，这些特征与炎症的化解、伤口愈合和IL-1β的抑制有关(图5B；图S7B)。MF3表达的基因与组织损伤的促炎性反应(CLEC2D、IL7R、OGT)和促炎性信号传导(FYN、DUSP4、FOXO1)有关。这一簇中的巨噬细胞表达CCL5，这是一种细胞因子，此前被认为与HER2靶向治疗后促进残余HER2+乳腺癌存活有关。MF4由增殖的髓系细胞群组成(TOP2A、MKI67)，组间差异无统计学意义。
在MF2组中，PD组巨噬细胞过多(图5A)，且表达促炎性细胞因子CXCL9、CXCL10和CXCL11(图5B；图S7B)，有利于淋巴细胞聚集进入TME。该群中最显著差异表达的基因还包括与冠苷酸结合的家族蛋白GBP1和GBP5，它们在IFN-γ活化的巨噬细胞中被诱导，并通过炎性小体组装促进先天免疫系统内的炎症信号传导(图5B；图S7B)。尽管MF2巨噬细胞中有促炎基因的表达，但PD组特异性巨噬细胞中最显著的差异表达基因是IDO1(图5B)。IDO1是由TME内的炎症诱导，并通过免疫抑制髓系细胞群、调节性T细胞(Treg)分化和免疫抑制细胞因子促进致敏环境。
10 免疫抑制T细胞表型在帕金森病的TME中占主导地位
T细胞和NK细胞(n = 2226)以巨噬细胞的方式进行分析，得到5个不同的T/NK细胞群(图5C；图S7C)。这些包括在TN样本中富集的两个种群(TC0、TC4)和在PD中富集的两个种群(TC1、TC2)(图5C和5D；图S7D)。在RD肿瘤中，T细胞总体比例较高(图4C)，并且在RD中没有单个T细胞簇显示T细胞过剩(图5C)。
TN和PD状态的 T细胞均显示T细胞浸润相对减少(图4C)。TN状态下的T细胞被富集为T细胞群TC4和TC0。TC4表达与自然杀伤(NK)或自然杀伤T细胞(NKT)表型一致的标记物，包括NK细胞标记物(KIR2DL3、FCGR3A)和中度表达的T细胞标记物(CD3、CD8)。TC0表现为CD8+表型，CCR7、IL7R和SELL均有表达(图5D；图S7D)。虽然PD状态时T细胞浸润仍有限(图4C)，但具有免疫抑制特征的T细胞表型(包括T细胞簇TC1和TC2)相对富集(图5C)。TC1被鉴定为一个功能失调或衰竭表型的T细胞簇，其特征是抑制受体PDCD1(编码PD-1蛋白)和CTLA4的表达(图5D)。TC2由表达FOXP3、IL2RA的Treg细胞组成。与相对免疫抑制的环境一致，PD时NK/NKT细胞簇TC4的浸润增加。
RD的肿瘤活检显示，TN或PD活检样本中存在更加促炎性的TME，表现为T细胞总体比例增加，调控性T细胞浸润减少(TC2)(图5E)。与PD状态相比，RD时功能障碍T细胞(TC1)减少，NK/NKT细胞(TC4)浸润增多(图5D；图S7D)。在所有治疗状态(TC3)中都有增殖的肿瘤浸润T细胞，并且在PD样本中轻度富集。该T细胞群以细胞毒性表型(CD8、GZYMB)和PDL1/CTLA4表达为特征，可能反映了功能失调前的细胞毒性T细胞群。
综上所述，TN和PD TME的特征都是巨噬细胞相对于T细胞浸润；然而，这些浸润性免疫细胞的表型特征在两组之间存在差异。PD时，有IDO1+巨噬细胞群浸润，有增殖的调节性T细胞浸润，在TN和RD时有少量的功能障碍T细胞浸润。相反，TN状态的特征是具有典型免疫抑制作用的M2样巨噬细胞占优势。然而，RD中没有功能失调或免疫抑制基因表达模式的T细胞浸润增加，免疫抑制巨噬细胞浸润减少(图5E)。
图5 在每个治疗时间点内，免疫细胞亚群表现出独特的转录特征。
结论
靶向治疗前后转移性肺癌活检的分析揭示了影响临床结果的分子和适应性免疫。1. scRNA-seq在转移性人类NSCLC中是可行的，并显示了丰富的肿瘤系统：2. 个体肿瘤和癌细胞表现出大量的分子多样性；3. 肿瘤和肿瘤微环境细胞表现出明显的治疗诱导的可塑性；4. 转移性NSCLC的scRNA-seq揭示了改善临床结果的新机会。