科研 |FUNCT INTEGR GENOMIC：转录组分析研究不同水稻品种对细菌条斑病的侵染（国人佳作）
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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细菌性条斑病(BLS)是目前水稻的第四大疾病。Dular和H359是两种对BLS有明显的水稻品种。Dular品种抗性较高而H359品种易感。本研究使用RNA-seq研究接种细菌性条斑菌不同时间后Dular和H359的抗性反应的早期分子过程。差异表达基因分析发现，在12和24小时后，Dular中有3031个DEGs和H359中有7161个DEGs。H359中的差异表达基因明显多于Dular，下调基因明显多于上调基因。GO和KEGG富集分析显示，Dular品种中的一些上调差异表达基因在苯基丙烷代谢通路中显著富集。进一步比较和分析表明，两个品种中抗性相关的基因数量在感染BLS24小时后明显下降，抗性相关基因在早期阶段主要包括WRKY转录因子、受体激酶和MAPK信号通路相关基因。本研究表明，抗性相关基因在感染早期发挥重要作用，本丙烷代谢相关基因可能响应Dular对BLS的抗性，从而为今后水稻BLS抗性的分子机制研究提供重要信息。
论文ID
原名：Transcriptome analysis of different rice cultivars provides novel insights into the rice response to bacterial leaf streak infection
译名：转录组分析研究不同水稻品种对细菌条斑病的侵染
期刊：Functional & Integrative Genomics
IF：3.058
发表时间：2020年2月
通讯作者：李生平
通讯作者单位：福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室
DOI号：10.1007/s10142-020-00744-x
实验设计
结果
BLS病变初期呈很小，深绿色的斑点，很快扩散到叶脉之间的深绿色到黄褐色的小斑点。病变部位会有大量黄色液体小珠。在感染严重下，条纹会呈现不规则的黄褐色斑点，类似于细菌性叶枯病。Dular感染BLS后会表现出较强的抗性，会抑制病变的扩散。BLS感染10天后，Dular病变长度一般小于0.5cm，然后H359的病变会快速扩散并达到5cm以上（图1）。
2 Dular和H359接种BLS不同时间后DEGs的鉴定
使用BGISEQ-500平台测序24个样本。使用Trimmomatic对raw data进行过滤，得到clean reads。每个样本平均数据量为6.27G，平均比对效率为90.58%（表1）。共检测到40378个基因，其中已知基因为39248。
在Dular感染BLS12小时和24小时后，共鉴定到3031个差异表达基因（DEGs），其中感染12小时后共有1671个DEGs，在感染24小时后共有1675个DEG（图2a），其中共有差异表达基因316个。H359感染BLS后共鉴定到7161个DEGs，H359感染12小时后共有6219个DEGs，感染24小时后共有1566个DEGs（图2a），共有差异表达基因624个（图2b）。其中D12h，D24h，H12h和H24h的特有差异表达基因分别为739，6704773和508个（图2b）。有趣的是，感染12h后的H359个差异表达基因比Dular的DEGs显著增多（图2c和2d）。
图2. 从2个水稻品种(Dular和H359)感染BLS的不同时间点(12和24 h)的转录组测序鉴定到的DEGs。a. 接种后12和24 h，在Dular和H359中共鉴定到10192个DEGs。b. 韦恩图显示接种BLS后D12h、D24h、H12h、H24h与健康水稻组织的DEGs重叠。c和d.火山图。
3 Dular和H359感染BLS的DEG GO分析
对从D12h，D24h，H12h和H24h获得的DEG进行GO富集分析。结果表明，所有鉴定的基因注释到不同的功能类别。在D12h，1241个基因注释到27个功能类别。在D24h，1112个基因注释到42个功能类别。这些功能主要分为三类（生物过程、细胞成分和分子功能）。在生物过程中细胞过程占主要地位，而在细胞组成和分子功能中，细胞和结合占主要地位（图3a）。在H12h，4751个基因注释到46个功能类别。在H24h，1088个基因注释到40个功能类别。这些功能同样主要分为三类（图3b）。
有趣的是，Dular和H359共有42个GO terms。有4个GO terms是H359中特有的分别为解毒、类核、分子载体活性和蛋白质标签，揭示了BLS抗性基因。此外，在共有的42个GO terms中，免疫系统过程、应激反应、病毒粒子等过程与BLS反应一致。然而，虽然存在一些共有GO terms，但是不用品种和不同病原体防御机制之间仍然存在巨大的多样性。
4 BLS感染Dular和H359的DEGS的KEGG分析
对DEGs进行KEGG分析，研究DEGs涉及的生化、代谢和信号转导通路。D12h共有750个DEGs注释到KEGG通路，H12h共有2756个DEGs注释到KEGG通路，这些DEGs涉及114条通路（图4a）和135条通路（图4b）。这些通路主要涉及mRNA检测，苯丙氨酸类生物合成和MAPL信号转导（表2）。作者发现Dular中上调的DEGs显著富集在一些与苯丙烷代谢有关的通路，包括类苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成。
5 感染12h和24h后防御相关基因的比较分析
越来越多的研究表明，转录因子受体激酶疾病相关基因、激素相关基因广泛参与植物防御调控。本研究发现，43个受体激酶应答基因、20个转录因子基因、19个疾病相关基因、15个激素相关基因和8个MAPK信号通路相关基因差异表达。然而在24h时仅鉴定到24、9、13、7和4个这样的基因（表3）。这些差异表达基因参与了水稻与BLS的互作。更重要的是，在接种BLS24h后，防御相关DEGs数量比接种12h后显著减少（表3）。这些结果表明，防御基因在感染BLS早期发挥了重要作用。
6 D12h和H12h中防御相关DEGs的调节
作者的结果表明，防御相关DEGs在接种12h后起到关键作用。因此，作者进一步分析了D12h和H12h的DEGs。本研究鉴定到了WRKY、NAC、MYB和BHLH转录因子，其中包括七个WRKY家族成员，四个NAC家族成员。这些基因在D12h下调表达而在H12h上调表达。鉴定到六个MYB家族成员，5个下调表达和三个BHLH家族成员。9个DEGs是参与植物病原体互作的受体激酶。19个疾病相关的DEGs有6个为NBS-LRR基因。同时发现了六种激素相关的DEGs，主要在D12h和H12h中下调表达。
此外，作者使用Cluster 3.0软件对这些防御相关DEGs进行了研究。这些DEGs大多涉及免疫响应。两个品种的基因表达趋势差异较大（图5），这可能是导致两个品种抗性水平差异的原因。这一结果表明，Dular与H359的DEGs差异分析有助于解释宿主与病原体的相互作用机制。
7 qRT-PCR验证
为了验证RNA-Seq结果的准确性，作者在12h随机选取具有潜在重要功能的Dular和H359的6个DEGs进行qPCR分析。接种后12小时RNA-Seq和qRT-PCR的数据显示，在六个被测基因中，BLS诱导的转录本变异程度基本一致（表4）。
讨论
BLS是水稻的主要细菌性病害之一，会显著降低水稻的产量。BLS由Xoc引起，非宿主抗性基因介导。近年来作者利用Dular作为抗性资源开发了多个水稻品系。BLS研究的一般方法是通过抗性亲本和易感亲本杂交建立一个大的F2群体，然后通过分子标记筛选或高通量测序方法得到QTL的大致位置。最后建立了一个亚种群用于对BLS抗性QTL的精细定位。胁迫条件下植物的转录组分析可以为植物提供了全面的生物信息。因此，RNA-seq已被成功地应用于研究不同的基因表达在许多系统中的差异。然而，目前还没有水稻对BLS反应的转录组分析研究报道。
1 水稻对BLS感染反应的防御相关基因
在本文中，作者利用转录组测序技术揭示了对BLS的侵染反应，结果显示许多DEGs被报道与植物抗病性有关。例如，一些WRKY家庭成员被确认，包括OsWRKY62和OsWRKY76。有报道称OsWRKY62是水稻先天免疫应答的负调控因子，是基础防御的有效调控因子。水杨酸处理后OsWRKY62表达水平增加。许多关于OsWRKY76的研究报道，它能够结合序列特异性的W-box元件，并表现出W-box介导的转录抑制因子活性。OsWRKY76过表达水稻植株对稻瘟病和白叶枯病的敏感性显著提高，sWRKY76过表达水稻植株对稻瘟病和白叶枯病的敏感性显著提高，因此，OsWRKY76在稻瘟病抗性和抗逆性方面发挥着相反的双重作用。鉴定了NAC家族的4个DEGs，其中包括ONAC131。研究表明，ONAC131可通过麦娜普菌感染和水杨酸、茉莉酸甲酯或1-氨基环丙基-1-羧酸处理诱导产生，ONAC131通过调控其它防御和信号相关基因的表达在水稻抗病中发挥重要作用。鉴定出43个差异表达的激酶响应基因，其中包括OsPGIP1。据报道，OsPGIP1可以抑制索根孢囊菌感染引起的多半乳糖醛酸酶的活性，防止其对水稻细胞壁的降解，从而提高水稻对索根孢囊菌的抗性。
许多研究表明，植物激素在植物病害防御中也发挥着重要作用。例如BRs通过调控一系列致病基因的表达产生致病蛋白(PRPs)来对抗病原菌。SA可以增加超氧化物歧化酶产生酶的活性，导致H2O2含量的增加，引起植物的一系列过敏反应(HRs)，最终提高植物的抗病性。作者鉴定了15个激素相关基因，包括OsGH3-2和OsJAZ8。研究表明OsGH3-2编码一种酶，催化IAA与氨基酸结合，并参与调控水稻中生长素和脱落酸的含量。OsGH3-2的激活促进了IAA的形成，抑制了基因的延伸，从而提高了水稻的广谱抗性。已有研究表明，这些基因在植物抗病性中发挥着重要作用，证实了作者的结果的可靠性。
2 水稻对BLS感染反应的分子机制分析
在水稻对BLS侵染反应的分子机制研究中，实验结果发现，两个品种接种BLS后24h防御相关基因的减少比接种12h更明显。防御相关基因在24h后急剧下降，这可能表明与BLS抗性有关的基因在水稻防御早期发挥了关键作用。
H359接种12h后的DEGs更多。作者推测，由于Dular对BLS具有抗性,因此它不需要激活其他功能基因,共同抵抗病原菌的入侵。H359对BLS易感，需要更多的基因参与响应。此外，作者对H359和Dular的GO和KEGG分析发现，H359比Dular含有更多的功能分类和途径丰富的DEGs。有趣的是，H359和Dular个GO和KEGG分析，作者发现Dular显著富集苯丙代谢通路，包括苯丙氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成。据报道这些同类与植物抗病性密切相关。例如，miR885介导的调控拟南芥免疫中的苯丙氨酸生物合成途径，苯丙氨酸途径中的苯丙氨酸解氨酶(PALs)被认为具有广谱抗病性(BSR)且无产量损失，黄酮类化合物在活性氧的转运调节中发挥重要作用，色氨酸途径参与了水稻通过血清素生产对致病性感染的防御反应。同时DEGs的KEGG分析表明，两个品种的苯丙类生物合成显著富集，但根据上调DEGs的KEGG分析，仅富集于Dular。因此作者认为，苯丙烷代谢相关基因的上调可能是Dular在BLS感染时比H359更耐BLS的原因。许多转录组测序结果表明，当植物被病原菌感染时，大部分RNA- Seq结果显示上调的DEGs数量大于下调的DEGs数量。但作者的结果显示，下调的基因明显多于上调的基因，qRT-PCR验证结果也与这一趋势一致。综上所述，这些发现可能表明在水稻中存在多种潜在的BLS反应机制。
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