科研 | Water Research：高质量处理废水仍会引起自然微生物群落和intI1基因丰度的显著变化
编译：萍水相逢，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
本文通过中试实验评估了高质量处理的废水 (HQWR)对淡水细菌的影响。高质量处理废水在农业中被重复利用，而实验所用淡水细菌几乎未受人为污染。
本文主要对比了处理组和对照组之间细菌群落丰度和组成及抗性基因丰度之间的差异性。2个处理组为在未受污染的湖水和高质量处理的废水中加或不加头孢噻肟(cefotaxime))，对照组为来源于未受污染的湖水。
结果显示：(1) 不添加头孢噻污的对照组tetA、arsB、czcA和intI1基因的丰度显著高于对照组，而添加了头孢噻肟的对照组无显著差异。而与carbapenems、b-lactams、fluoroquinolones和 macrolides抗生素相关的抗性基因未被检测到。(2) 处理组中可获得的高营养更有利于细菌的生长，尤其是Acinetobacter spp. 和Pseudomonas spp.在培养22天后有明显的富集。处理组中头孢噻污的存在引起Acinetobacter spp.细菌的富集，表明抗性形式可能具有除blaCTX-M, blaOXA和blaKPC以外的抗性基因。
尽管结果是来自连续培养的中试实验，但仍应引起注意，人们仍需规范再生水在农业中的使用，因为即使是经过高质量处理的废水也可能对细菌群落的组成合抗性基因的扩散产生不良影响。
论文ID
原名：High-quality treated wastewater cause sremarkable changes in natural microbial communities and intI1 gene abundance
译名：高质量的处理废水会引起自然微生物群落和intI1基因丰度的显著变化
期刊：Water Research
IF：7.05
发表时间：2019.7.22
通讯作者：Jèssica Subirats
通讯作者单位：西班牙赫罗纳大学
材料与方法
1 韦尔巴尼亚的城市废水污水处理厂 (UWTP)
2 实验设计
3 采样及样品处理
4 抗生素分析
5 细菌丰度测定及DNA提取
6 抗性基因定量
7 高通量测序及数据处理
8 数据分析
结果
第一天，处理组 (HQWR和HQWR+AB)N、P、S的浓度分别比控制组 (CT)的高20、15、3倍。相反，控制组中NH4+的浓度比处理组的高3倍，而控制组和处理组间TOC和有机N浓度相当 (见附表4)。
Cefotaxime仅在HQWR+AB水样中检测到，平均浓度为5.19 ± 0.03 μg·L-1。抗生素浓度在实验期间有轻微的下降 (4.42 ± 0.29 μg·L-1)。在实验开始之前，控制组(CT)和处理组 (HQWR、HQWR+AB)中细菌浓度分别为8.69 ×105和 5.80 ×105 cells· ml-1。因为这些细胞来源于高压灭菌的泻湖湖水，因此无法存活。接种的细菌细胞浓度为8.12 ×106 ± 6.55×105 cells· ml-1。
从第4天到实验结束，CT组平均细胞浓度维持在1.49 × 106 ± 9.75 × 105 cells· ml-1，随时间变化不明显（One-way ANOVA，p=0.06）。然而， CT组的细胞丰度的均值显著低于HQWR（One-way ANOVA，p < 0.001）和HQWR+AB（One-way ANOVA，p < 0.001）处理组。在HQWR (细胞均值：3.63×106 ± 1.18×106 cells· ml-1)和HQWR + AB (细胞均值：3.81×106 ± 2.32×106cells· ml-1)处理中，细胞丰度没有显着差异（One-way ANOVA，p = 0.744）， 并且在整个实验期间几乎保持不变，除了在第20天浓度达到峰值。
在所有样品中，与头孢噻肟（blaCTX-M、blaOXA、blaKPC），β-内酰胺类（blaTEM），氟喹诺酮类（qnrS）和大环内酯类（ermB）相关的抗性基因始终低于检测限。所有测试的ARGs中，仅检测到sul2、tetA、intI1、arsB和czcA基因。所有这些基因在培养基和接种菌液中也检测到。特别是，sul2是在CT处理的进料培养基中检测到的唯一基因，而在处理组的进料培养基（HQWR和HQWR + AB）中也检测到了tetA和czcA，相对浓度范围为1.69 ×10-3至1.35×10-2copies·16S rRNA-1。所有靶基因在接种物中均检测到，但浓度低于处理组的进料培养基中的浓度。
22天后，HQWR和HQWR + AB处理组间intI1基因的相对浓度相近，并且显着高于CT组（Kruskal-Wallis检验，p = 0.010）。但是，intI1丰度在所有底物（水/生物膜）上没有显著差异（Kruskal-Wallis检验，p = 0.119）。sul2基因的相对丰度既不受处理（Two-way ANOVA，p = 0.214），也不受底物（Two-way ANOVA，p = 0.37）的影响。尽管如此，与生物膜样品相比，HQWR + AB处理对水样品中sul2的浓度影响更为明显。相关因素“处理”和“底物”之间的显着相互作用进一步证实了这一观察结果（Two-way ANOVA，p = 0.043）。在所有生物膜样品中均未检测到tetA，但仅在HQWR和HQWR waterAB的水样品中检测到，且处理之间无显著差异（Kruskal-Wallis试验，p = 0.942）。
当比较与重金属相关的抗性基因（czcA和arsB）的相对和绝对丰度时，得到了不同的结果。czcA基因的相对丰度既不受处理（Two-way ANOVA，p = 0.098），也不受底物（Two-way ANOVA，p = 0.148）的影响。在所有生物膜样品中均检测到arsB基因，但仅在从HQWR和HQWR + AB处理收集的水样中检测到了arsB基因，两种处理间无明显差异（Two-way ANOVA，p = 0.114）。在HQWR和HQWR+ AB处理之间，czcA和arsB基因的绝对浓度相似，并比CT组至少高出一个数量级，并且与底物无关。但是，只有生物膜样品中的czcA基因和水样中的arsB基因显示出显著着差异（分别为p = 0.009和p = 0.001）。
接种菌的细菌群落主要由拟杆菌属（48.41±11.33％）β-变形杆菌（17.75±4.03％）和放线菌属（11.85±1.97％）组成（图3）。22天后，浮游生物和生物膜细菌群落则主要由β-变形杆菌（42.57±18.74％; 25.52±2.73％），疣微菌门（28.08±14.17％; 19.63±5.31％）和Alfaproteobacteria（13.77±10.26％; 13.48± 1.39％）的组成。
用Bray-Curtis相似距离评估了处理方式和底物类型对浮游生物膜和生物膜细菌群落组成的影响（图4）。主坐标分析（PCoA）表明，底物类型可解释40.4％的变异（PERMANOVA，p< 0.001）（图4A）。在控制条件下，细菌群落的组成聚集在一起，并与处理组的细菌群落显著分离（HQWR（p < 0.001）和HQWR+ AB（p < 0.001）），而与底物类型无关（图4A）。尽管如此，来自HQWR和HQWR + AB的细菌群落在组成上也显示出显差异（p = 0.004）（图4B）。
CT和处理组（HQWR和HQWR + AB）之间细菌群落组成的差异主要归因于不动杆菌属和假单胞菌属序列的相对丰度的变化，以及未分类的疣状微生物（图5）。不动杆菌属和假单胞菌属的序列分别占CT总体细菌群落的0.005±0.0％和0.28±0.29％，但在处理组中（HQWR和HQWR+ AB）增加到14.15±3.05％和13.39±6.54％。相反，与控制组相比，在处理组中，疣状微生物相关的序列的相对丰度降低了16.33％（图5；表1）
讨论
本文的主要目的就是在控制条件下，探究HQWR对未直接受人类污染的水体细菌群落结构组成和丰度的影响。HQWR对大多数基因（tetA，intI1，arsB和czcA）的丰度具有重大影响。但是，在HQWR中添加5 mg·L-1的头孢噻肟（第三代头孢菌素）不会对所分析基因的丰度造成严重影响，因为与第三代头孢菌素（blaCTX-M，blaOXA和blaKPC）相关的基因均未在任何样品中检测到。这些结果表明，尽管选择的细菌对头孢噻肟耐药，但在我们的实验条件下暴露于5 mg·L-1头孢噻肟中可能不会导致对头孢噻肟的耐药性的新生突变。
先前的研究已经强调，在特定环境下，抗生素的亚抑制浓度可能有助于在特定细菌群落中维持和选择耐药细菌，从而改变其组成。在HQWR中测量的属于主要抗生素家族的53种抗生素的浓度低于检出限（范围为3.6 ng·L-1至36 ng·L-1，见附表6）。具体而言，所分析的四种四环素抗生素的检出限为8.1至25.2 ng·L-1。在这点而言，暴露于HQWR的浮游生物群落中tetA基因相对丰度的增加表明，即使在非常低的抗生素浓度（< 25.2 ng·L-1）下，四环素细菌抗性的维持和选择也可能发生。尽管如此，观tetA基因相对丰度的增加可能是在HQWR中存在的不同胁迫因素（包括营养负荷）的综合作用的结果。与对照培养基相比，代谢速率提高，HQWR中较高的营养物浓度可能有利于细菌群落内的HGT事件的发生。实际上，暴露于HQWR和含有低剂量头孢噻肟的HQWR中的细菌群落比暴露在对照培养基中的细菌群落显示出更高的生长速率，这可能是由于大量的不稳定营养素的存在。
最近的研究表明，在药物化合物的共同作用下，营养物质可能会诱导溪流生物膜中intI1基因的丰度增加。这些发现可能为暴露于HQWR的生物膜和浮游细菌群落中intI1基因的广泛存在提供了合理的解释。这些结果支持以下假设：即使细菌群落暴露于被认为可安全用于农业灌溉的高质量废水中，但intI1基因可表征人为污染的存在 (即intI1基因可作为人为污染的存在的替代物)。这尤其令人担忧，因为intI1基因通常与多个抗性基因连锁，因此有利于与抗生素和金属抗性相关的基因的共选择。在这方面，我们的研究还表明，HQWR也可能有利于MRGs的持久性，这可能是由于低浓度的金属引起的（附表1）。因此，如果ARGs和MRGs都位于质粒中的遗传平台（例如1类整合子）中，那么它在没有抗生素的情况下也可维持和选择细菌群落中的抗生素抗性。
我们还调查了浮游生物群落和生物膜群落之间适应的潜在差异。研究结果表明，浮游生物群落对环境压力的敏感性往往高于生物膜上的。生物膜群落的较高抵抗力可能是由于多糖的胞外基质赋予了其对环境危害的固有保护作用。尽管多糖生物膜基质的复杂结构使生物膜细菌对抗菌药物的敏感性比浮游细菌细胞低10至100倍，但它也为基因转移提供了良好的环境。除其他功能外，这一功能使细菌生物膜被认为是评估长期人为污染暴露对地表水中抗生素耐药性流行率的影响的合适生物传感器。
在水生生态系统中，环境因素在影响细菌群落组成方面起着关键作用。先前的研究表明，废水可以通过改变栖息地的理化特性和引入废水相关细菌来改变接收水域的微生物群落。在这里，我们证明了HQWR还可以显著改变从未直接暴露于人为污染的细菌群落组成。暴露在HQWR 22天后，浮游细菌和生物膜细菌群落均富集不动杆菌属和假单胞菌属细菌。此结果可能主要是由于培养基中存在的溶解性有机物（DOM）的化学特性不同。对照处理中的培养基是来自Mercurago Lagoon（意大利）的天然水，该水具有高比例的难溶有机碳，其中包括高分子量和结构复杂的化合物（例如腐殖酸和木质素）。处理后的废水富含不稳定的有机碳，有利于细菌的生长，尤其是在选择压力下（例如废水中的化学应激源）具有良好竞争性的细菌，例如不动杆菌属和假单胞菌属。此外，在HQWR中加入5 mg/L的头孢噻肟抗生素有利于不动杆菌属，这表明它们可能携带与头孢噻肟抗性相关的基因，而不是本研究中分析的那些基因（blaCTX-M, blaOXA和blaKPC）。实际上，不动杆菌属携带与碳青霉烯类耐药性相关的不同基因，例如blaVIM，blaIMP和blaSIM，并容易获得对氨基糖苷类，氨苄青霉素，四环素，庆大霉素和妥布霉素的抗性。与不动杆菌属不同，假单胞菌属的细菌对头孢噻肟抗生素敏感，因为暴露于HQWR + AB处理的那些样品中它们的相对丰度降低了。
不动杆菌和假单胞菌属物种在暴露于HQWR的样品中富集是一个重要的结果，因为这两个属都包含与医院感染相关的几种对多药耐药的人类病原体。自从通过食用在废水回用的土壤中再生长的农作物将ARB和ARGs引入食物链以来，用于灌溉的废水可能会导致潜在的人类健康影响。
结论
本文研究结果表明，HQWR中新出现的污染物的存在和养分的可利用性可能对环境构成巨大威胁。具体而言，再生废水显著地增加抗性基因库以及水生环境细菌种群之间基因转移的可能性。此外，HQWR有利于不动杆菌和假单胞菌的生长。在浮游生物群落中，这两个属都包含多药耐药性机会病原体。尽管仍然存在许多知识空白，无法确定抗生素抗性从环境向人类传播的风险，但是将经过处理的高质量废水用于农业灌溉可能对人类健康构成直接威胁。从这个意义上讲，本文强调需要进行原位真实规模实验，并且在必要时重新定义再生水参数的适用性，并对安全使用再生水实施严格的规程，以避免对微生物群落的分布和环境中抗菌素耐药性的传播产生不良影响。
你可能还喜欢
这些或许也适合你哦👇