科研 | SBB：宏基因组学等多组学联合揭示了磷酸盐的添加通过抑制微生物的生长从而增加了热带森林土壤的呼吸作用
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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热带生态系统是大气CO2的重要汇，但植物的生长受到磷（P）有效性的制约。虽然土壤微生物菌群促进了有机磷的周转和无机磷的活化，但它们在碳-磷耦合过程中的作用仍然知之甚少。为了探究这一原因，在受控的实验室条件下，从波多黎各（puerto rico）El Yunque国家森林中代表高度风化的热带土壤的四个地点采集的土壤样本与外源PO43−共同培育。与对照相比，除土壤全磷和生物有效性最高的土壤外，P的添加使所有供试土壤的CO2呼吸增加了14%~23%。宏转录组学研究发现，P的添加使参与细胞生长和吸收其他养分的基因的相对转录有所增加。通过群体水平相对丰度（DNA）来归一化基因表达的新方法表明，P的添加提高了整个群落范围内细胞生长和分裂基因的转录水平。土壤群落对磷的响应使的α-葡糖多糖生物合成基因的相对丰度升高，这表明在磷限制条件下，土壤群落的碳贮量有所增加。调控α-葡糖多糖降解的磷酸化酶基因同样更加丰富，并随着磷的添加其相对转录增加。相反，土壤中具有代谢调节作用的土壤微生物对P的添加并未表现出响应状态。综上所述，本研究提供了解除磷限制后土壤呼吸增加的定量评估，并阐明了参与这一响应的几个潜在的生态和分子机制。
论文ID
原名：Phosphate addition increases tropical forest soil respiration primarily by deconstraining microbial population growth
译名：磷酸盐的添加通过抑制微生物的生长从而增加了热带森林土壤的呼吸作用
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019年3月
通讯作者：Konstantinos T Konstantinidis
作者单位：佐治亚理工学院
实验设计
本研究土壤样本采集自波多黎各（puerto rico）El Yunque国家森林地点（距海平面350米），所采集的土壤样本（约100 g）添加到灭菌的250毫升容器中，并添加3 mL磷酸钠溶液（相当于每克土壤P含量为30μg）随机混合均匀，以作为P添加（P+）处理组；添加等体积水作为对照组（P-）。第一次培养实验持续约6天，4个采样点每个采样点两组处理（P+和P-），每组处理三个重复，以比较P+和P-条件下的土壤呼吸作用，实验过程中约每2.16小时测量和记录一次顶空气体。第二次培养实验持续约14天，实验过程中每隔约2.96小时记录气体测量。在每次实验结束时进行样本采集，以进行土壤微生物分析。
结果
1 培养过程中环境因子与CO2呼吸的关系
本研究采样点土壤样本之间的土壤速效磷存在差异显著（P<0.05）。其中Bisleyridge（BR）样地和ElVerde valley（EV）的土壤速效磷最低，El Verde ridge（ER）样地居中，Bisleyvalley（BV）样地最大（表1）。土壤速效磷与微生物量磷（MBP）表现出正相关关系（R2=0.82）。土壤微生物量碳（MBC）（R2=0.77）和微生物量氮（MBN）（R2=0.60）与MBP之间同样表现出正相关关系。磷的添加（P+）显著增加了EV、ER和BR土壤的CO2呼吸，但对BV土壤CO2却没有影响，因此表现出有影响的土壤被定义为具有“磷响应”土壤，而BV土壤样本被定义为“磷无响应”土壤（图1）。在ridge土壤中，P的添加增加了CO2呼吸，这与MBC/MBP比值呈正相关关系（R2=0.86），即基于MBC：MBP比值，磷限制程度越高的土壤所产生的响应越大。
2 有机碳降解和磷酸酯酶活性
基于酶功能分析、宏基因组测序、宏转录组测序等方法对不同采集点收集的相同土壤样本进行分析。由于EV土壤样本中很难获得高质量的RNA，因此酶功能分析和组学效应仅分析了ER和BR（P响应土壤）以及BV（P不响应土壤）土壤样本。作为对照，同样对未培养的土壤样本进行酶分析。基于有机碳降解酶活性（SOC，如α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-D-纤维素生物苷酶、N-乙酰β-氨基葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶）和磷酸二酯酶活性（DIPHOS）之间的比率来评估酶活性。无论是田间土壤还是培养土壤，在磷响应土壤中，DIPHOS的活性都比SOC降解酶的活性高约2.5~54倍（图2）。与ridge土壤样本相比，BV土壤的所有五种SOC降解酶的活性比率都明显升高。此外，与田间土壤样本以及P添加的培养土壤样本相比，基于培养条件下的P+ridge土壤的β-D-纤维素生物苷酶相对活性显著增加（P<0.05），α-葡萄糖苷酶（p<0.1）和β-葡萄糖苷酶（p<0.1）活性也表现出近乎显著的增加趋势。
3 土壤群落组成特征
作为代表，本研究分别测定了代表ER、BR和BV培养土壤的10个宏基因组文库，以及8个代表基于培养条件下的磷响应的ER、BR对照（P-）以及P添加（P+）的宏转录本。基于双端拼接、质检以及rRNA序列过滤之后，共获得2 Gbp的宏转录本以及12.2 Gbp的宏基因组数据。
通过Nonpareil 3（一种生物信息学工具），根据所获得的宏基因组读数的冗余水平来确定有多少提取的DNA被测序，其中BV土壤中的微生物群落比ER和BR土壤中的微生物群落更加多样化。从宏基因组16S rRNA基因片段中提取的细菌门的组成在不同的ridge土壤之间具有相似性，其中在ridge和BV土之间更明显，这与上述经Nonpareil处理的多样性结果相一致。其中Verrucommicrobia丰度在ER和BR之间有显著差异（P<0.05）。相比之下，几个细菌门的丰度在ridge土壤和BV土壤之间存在显著差异，这其中包括Chloroflei（ridge土壤和BV土壤分别为2.2%和7.2%）、Firmicuts（1.0%对0.5%）、Gemmatmonadetes（0.2%对1.3%）、Latesciacteres（0%对1.4%）、Nitrosprae（0.1%对4.3%）、Planctomycella（8.2%对6.8%）和Proteobacteria（40.4对35.9%）。基于kmer构成从而进行β多样性计算的工具，同样也揭示了ER和BR之间的相似性，而不是ER/BR和BV之间的相似性。群落组成分析显示，一般来说，在培养条件下，P+和P-的宏基因组之间有很大程度的重叠（图3）。因此，在培养条件下，P+和P-土壤群落之间的比较仅限于宏转录组学数据的分析。
4 α-葡萄糖聚合物生物合成、代谢合成和分解过程以及细胞分裂基因的丰度和转录本活性
与培养条件下的P-土壤相比，涉及嘌呤（purABCDEFHKMT，guaAB）、嘧啶（carAB，pyr1BCDEFHG，NDK，nrdAB）以及甘油磷脂（tpiA，GSPA，plsBCXY，pls，CDSA）生物合成的基因的通常随着P的添加（P+），其相对转录也有所增加（图4）。由通用DCW操纵子编码的基因的相对转录也通常随着P+的增加而增加（图4；具体见“细胞分裂和肽聚糖生物合成”类别）。一种多组学方法表明，P+促进微生物细胞分裂和生长的基因转录的增加存在于整个群落范围内，而不是仅限于少数群体（图5）。具体地说，>85%的DCW操纵子在P+条件下（与P-相比）具有更大的DNA标准化相对转录。
与无P响应的BV土壤样本相比，作用于α-葡萄糖聚合物的α-葡萄糖聚合物生物合成和磷酸化酶基因的相对DNA丰度通常在具有P响应的ridge土壤中更高（图3）。具有β-糖苷键的聚合物特有的磷酸化酶基因则有相反的趋势。此外，作用于碳水化合物的所有磷酸化酶的相对转录均随P+的增加而增加。对宏基因组重叠群的研究表明，具有P响应的土壤中的许多微生物菌群都含有编码大的α-葡萄糖聚合物的脱枝和磷酸化基因的基因组片段，如糖原脱支酶（EC3.2.1.196）和糖原/麦芽糊精磷酸化酶（EC2.4.1.1）。这些基因通常与核心分解代谢功能相关的基因或与细胞生长相关的几种生物合成前体的形成有关，例如参与D-ribose 5-P（核苷酸和ATP生物合成）、D-erythrose 4-P（氨基酸生物合成）和磷酸甘油（磷脂生物合成）形成的基因（概念代谢途径图见图6a，编码这些功能的恢复基因组片段见图6b）。
5 养分获取和储存基因的丰度和转录活性
虽然编码磷酸转运ATP酶复合体（pstABC）的基因的相对DNA丰度在不同位点之间没有显著差异，但在培育条件下ridge土壤样本宏基因组中编码磷酸盐结合蛋白（pstS）的相对DNA丰度比BV高42.6%（图3）。磷酸ABC转运体膜亚基基因（pstAC）的相对转录丰度在P+中增加（图4），而编码ATP结合蛋白的pstB和pstS却表现出减少的趋势（p<0.05）。涉及吸收、固定以及同化其他养分的基因通常在与P+中的相对转录中有所增加。这些基因包括与固氮（nifDHK）、铵输入（nrgA）、同化硝酸盐还原（nasABCD，nir）、硫结合和输入（cysATW，sbp）和钾输入（kdpABC）相关基因。
6 细胞应激和维持基因的转录活性
讨论
磷通常被认为是热带生态系统中限制生物活性的主要营养元素，但有关有效磷在调控热带土壤微生物群落组成和活性方面仍存在许多不确定性。本研究中，实验室培养条件下，除了全量和生物有效磷最高的样点，土壤磷处理（P+）使所有土壤的CO2呼吸增加了14-23%；ER、BR和EV对P+具有响应，而BV却未表现出响应（表1；图1）。这一结果与先前测量的土壤碳通量响应一致。与不具有P响应的BV土壤相比，磷响应土壤的ER和BR在总微生物群落分类和序列组成上更为相似。虽然BV土壤的全磷和生物有效磷含量在所有采样点中最高，且表现出对P+的不敏感性，但其磷浓度仍然被认为足够低，以至于限制了植物的生长。因此，BV土壤群落很可能受到其他养分的制约。高含沙量通常具有较低的土壤微生物群落，因此BV土壤群落也可能受到相对较高的含沙量的制约。宏转录组学表明，ridge土壤中的P+增加了许多参与细胞生长和复制的基因的相对转录（图4）。对细胞分裂和细胞壁（DCW）操纵子基因表达的群体水平研究表明，解除先前的磷营养限制普遍增加了与细胞生长和增殖有关的基因的相对转录（图5）。
除了对P+的急性生长响应外，田间土壤速效P与ridge的MBP、MBC和MBN呈正相关，反映了长期土壤P含量越高，持续生物量越大。这一结果与以往研究表明，随着长期施用磷肥，热带田间土壤微生物生物量增加。在另一项研究中，作者认为微生物生物量的增加可能是由于磷肥增加了植物凋落物的输入，但在邻近的土壤中，土壤中添加了加倍的植物凋落物输入，却没有观察到微生物生物量的增加。因此，虽然有机碳的数量传统上被认为是限制土壤微生物生物量和活性的因素，本研究的结果表明，在磷有限的热带土壤中，磷直接限制微生物细胞的生长和增殖。这可能是由于P对许多核心细胞基础结构成分的必要性，如DNA、RNA、ATP、NADPH和甘油磷脂。为了维持生长，微生物还需要吸收其他营养物质并提高分解代谢功能。因此，参与营养输入或同化以及产能分解代谢的基因通常在P+中有更大的相对转录（图4）。
以有研究证明，过量的有机碳但不足的磷会导致细胞内α-葡萄糖聚合物积累的。因此，与BV土壤相比，参与α-葡萄糖聚合物生物合成的基因在磷响应的ridge土壤中宏基因组具有更高的相对丰度（图3）。在磷限制、富碳条件下积累α-葡萄糖聚合物的土壤微生物群可以在磷有效性增强时利用磷酸化酶代谢α-葡萄糖底物。因此，这样的机制可以直接控制储存的有机底物的新陈代谢和下游的分解代谢和合成代谢活动。此外，我们确定了几个编码降解α-葡萄糖底物功能的基因组片段，包括糖原/麦芽糊精磷酸化酶、参与糖酵解的伴随基因和/或戊糖磷酸途径（图6）。这些片段可以代表一条流线型的通路，其中储存的有机底物被用来产生主要的生物合成前体，并在有利于细胞增殖和生长的条件下，通过产生能量的分解代谢来提高细胞的活性。这些恢复途径（图6a）和所有已调查的碳水化合物活性磷酸化酶基因的相对转录增加证明，储存的有机底物的使用增加可能是P+导致CO2呼吸增加的原因。
相反，β-葡萄糖聚合物（如纤维素和半纤维素）特有的磷酸化酶基因在对磷不敏感的BV土壤的宏基因组中更为丰富（图3）。由于ATP是葡糖激酶磷酸化葡萄糖所必须的，且在这些ATP在进程中被保留下来，因此的在土壤有效磷含量较高的条件下，利用磷酸解直接代谢植物来源的底物有助于代谢的进行。这些结果表明，不同底物类别的磷酸化酶基因可以作为反映土壤磷生物有效性的一个性状，并为微生物的生长和活性如何与土壤磷条件耦合并潜在地受到土壤磷条件的调控提供了机械性的见解。
结论
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