科研 | New Phytologist: 植物营养获取策略驱动表层土壤微生物结构和功能
编译：小新，编辑：小菌菌、江舜尧。
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我们知道植物营养获取策略驱动土壤进程和植被类型，但是目前针对上述变化对土壤微生物影响的研究还比较少。本研究预测随全球变化而变化的植被性质引起的微生物多样性和功能的变化具有重要意义。
本研究记录了波罗的海地区145个北方温带大陆地点的表土微生物群落，该地区在植被类型和营养特征上有很大的差异，例如菌根类型和共生固氮。我们发现与外生菌根（EM）植物为优势植物的栖息地相比，以丛枝菌根（AM）植物为优势植物的栖息地表土中有更多的AM真菌、细菌、腐生真菌、和病原菌。微生物组分的差异反映了AM土壤养分循环的快速性和植物-土壤的负反馈。在以EM为主的生境中，真菌多样性和菌真菌比率较低的原因是木质植被的单一优势以及EM真菌引起的土壤酸化，这与碳水化合物活性酶的多样性和相对丰度有关。本研究表明与全球变化和陆地使用相关的植被变化可能引起表土微生物结构和功能方面的显著变化。
论文ID
原名：Plantnutrient-acquisition strategies drive topsoil microbiome structure and function
译名：植物营养获取策略驱动表层土壤微生物结构和功能
期刊：New Phytologist
IF：8.512
发表时间：2020.04
通信作者：Mohammad Bahram
通信作者单位：塔尔图大学，瑞典农业科学大学
实验设计
1. 样品采集
本研究于2011-2016年于爱沙尼亚和拉脱维亚的波罗的海北部地区选取了145个区域【包括EM落叶植物（共16种）为优势植物的采样点73个，EM针叶植物（松科，3种）为优势植物的采样点16个，AM落叶植物（48种）为优势植物的采样点50个，AM针叶植物（菊科，2种）为优势植物的采样点6个。采样点中共有12个EM地块（灰桤木、欧洲桤木）和4个AM地块（树锦鸡儿、沙棘）均以固氮植物为主。无落叶植物的草地共有6个，田块8个。单个采样区域大小为2500㎡】，共采集5800份代表不同土壤类型与植物营养获取方式的样品【每个采样点收集40份样品，单个样本采集区域直径5㎝，深5㎝，不区分有机层和矿物层，采集后自然风干12h，混合均匀】。采样同时对植物种类、功能类型和面积等参数进行记录，林地记录不同种植物的相对丰度，田块和草地记录相对覆盖率，记录最近一次发生火灾的时间。从世界气候数据库（www.worldclim.org）中下载气象资料。该地区年平均温度和降水量分别为4.7-7.0℃和549-745㎜。初步研究结果表明研究区域内（400×400㎢）气候条件变化很小对微生物的影响可以忽略，因此在数据统计分析时排除了气候条件这个变量。参考Tedersoo等的方法，通过元素分析仪和同位素质谱仪测定全C、13C、全N、15N的含量。利用乳酸按溶液和1M的醋酸铵溶液分别测定全磷、全钾和钙元素、镁元素含量。
2. DNA提取及测序
通过扩增方法确定土壤类型及shotgunmetagenomics法明确土壤中功能组成。利用PowerMaxSoil DNA Isolation Mini kit (MoBio)试剂盒从2.0 g样品中提取总DNA，测序平台用Illumina HiSeq 2500。细菌和古细菌的扩增用引物515FB和926R。包括真菌在内的所有真核生物，使用引物ITS9MUNngs和ITS4ngsUni。对于真菌鉴定，我们使用PacBio平台，在区分物种，分类学精确度和（较低）人为因素比例方面优于其他平台。所有数据的登录号为ERP105926和PRJNA598043。
3. 生物信息学分析
3.1 基因组学
参照Bahram等的方法进行基因组学分析。首先进行序列质控，共获得980810505条序列。优化后序列通过FLASH软件进行拼接，接下来利用eggNOG数据库、CAZY数据库进行功能注释。我们注意到这种方法反映了生物体的潜在功能，这些功能不一定在转录本和酶水平上表达。与细菌和真菌病原体相比，森林土壤真菌在基因组数据库中的代表性不足，这将削弱对特定真菌类群的功能分配。
3.2 DNA条形码技术
16S序列分析使用LotuS 1.462pipeline，31286576个序列质控后获得22335463个序列，利用UPARSE (Edgar2013)以97%的序列相似性对上述序列进行聚类。使用UCHIME中RDP reference(http://drive5.com/uchime/rdp_gold.fa)运行reference-based和de novo chimerachecking检测并移除嵌合体OTUs。试验数据分析只针对丰度最高的类群。从真核细胞和叶绿体来源的序列中筛选细菌OTU丰度矩阵，并将其稀释到通用OTU的最低数目，以消除样品间测序深度的影响。利用Faprotax将细菌OTUs进行功能注释。
4. 数据分析
运用R语言vegan包的rrarefy函数将OTU丰度矩阵稀释一次使每个样本中的序列数量一致（细菌20000真菌500）以减少测序序列变化引起的误差。或者，使用具有总读取丰度平方根的模型的残差来分析丰富度。由于两种方法结果一致，本研究仅报道第二种方法的结果。分析过程中去除了5个来自缺氧环境的异常值，或者不包含在真菌细菌数据集中的一些细菌序列。
根据细菌与真菌基因组rRNA基因的比例计算B/F比值，该比值与PLFA密切相关，这与之前报道一致。我们在apepackage中进行主成分分析 (PCoA)，以便分析时考虑植物群落组成的因素。
对于单变量分析，确定了微生物丰富度和相对丰度的最佳预测因子，并使用机器学习方法将其包括在最终模型选择程序中，该方法在randomForest软件包的randomForest函数中实施。这种方法在做随机森林试验时被用来估测变量重要性。对于这一分析，我们包括25个生物和非生物变量，包括植被和土壤参数以及纬度、经度和高度。做随机森林分析时加入空间距离以分析数据的空间自相关，基于在veganpackage中不同样本的地理矩阵产生。为了进一步检验变量的直接和间接影响，我们在AMOS软件(SPSS)中建立了结构方程模型(SEM)，包括了基于它们在随机森林模型中重要性的预测因子。在先前的模型中，变量之间的所有间接和直接联系都是根据它们的相关性建立的。然后，我们删除了不重要的链接和变量，或者在错误项之间创建了新的连接，直到实现了一个重要的模型拟合。非参数Wilcoxon秩和检验分析差异，BenjaminiHochberg进行多次校正。运用R语言betareg package对组分做β回归，基于EM植被覆盖率建模。
结果
1. 微生物丰富度与多样性
经测序获得304248真菌序列分归于10325个OTU，7022893细菌序列分归于29813个OTU，此外还有521747093个序列归属于74298个细菌。
生物变量之间的相关性关系：土壤pH和15N与单位面积的EM/AM植物丰度比值显著相关；土壤C/N与EM针叶林组分显著相关（图S3）；植物多样性与AM针叶林丰度比率相关而与EM/AM植物丰度比值不相关；总生物量与树种类丰富度以及EM落叶林组分正相关与EM针叶林负相关（图S3）；除了细菌与真菌丰度比在EM生境中较低（针叶林更显著）（图1），微生物生物量不发生明显变化。随机森林分析结果显示尽管细菌与真菌丰度比与土壤pH和15N呈正相关，植物多样性、功能（N、C丰度）和菌根性状是绝对生物量的决定因素（图2）。
图1 在EM优势环境中土壤细菌功能组构成（%相对于真菌）和真菌功能组的相对丰度。数据点显示了每个地块中细菌和真菌（和真菌功能组）的相对丰度。根据单位面积估测EM植被的百分比计算EM优势程度。为了结果更好观察，将y轴上的相对丰度从0缩放到1。
图2 与微生物多样性和构成相关的生物和非生物因素。（A）随机森林热图表明微生物种类和功能组与植被、土壤性质和地理变量之间的关系。点的大小代表变量的重要性（根据out-of-bag-CV估计的平均下降精度的百分比）；红色代表正相关蓝色相反。植物组成1和2是前两个PCA轴，代表整个地块植物组成的变化。顶部的条形图表示out-of-bag变量，被用来解释每个模型X轴上的应变量。（B）基于(A)中检索的细菌和真菌相对丰度关系的最佳拟合结构方程模型。模型中的关系均达到显著水平(P<0.05)，Chi-Square test(P>0.1) 和PCLOSEtest (p>0.1)用来检验模型拟合（详细数据见表S2）。
细菌富集的主要决定因素分别为土壤pH（单峰关联，峰值为5-6）和植被性质的影响（图2）。然而，在以固氮植物为主的生境中，细菌丰富度最高，在针叶EM为主的生态系统中，细菌富集最低，土壤pH对其影响不显著（图2，S4）。与真菌情况类似，植物病原细菌在AM主导的地块中丰度较高（图S5）。尽管如此，EM栖息地中固氮细菌更为丰富，EM栖息地中土壤氮主要与有机物质结合。固氮植物对固氮或反硝化土壤细菌的相对丰度没有影响（图S5）。SEM模型表明，单位面积EM相对丰度与真菌丰度直接负相关关系以及通过提高土壤C/N与真菌富集间接负相关（图S4）。随着EM优势程度增加，除EM真菌外所有功能真菌的相对丰度和富集下降（图1）。分析时排除EM和AM菌根真菌，功能真菌组其它真菌差异虽小，也达到显著水平（图S6）。目前数据库（如UNITE）中的大多数真菌是由农业植物病菌组成的，分析数据时排除农田变量后，病原菌含量的EM/AM之间仍存在显著的负相关关系，这个结果表明，所观察到的植物病原菌模式不单单由这个潜在的偏好所驱动。相比于其它变量，空间变量对微生物相对丰度和富集的影响要小很多（图S7）。
2. 微生物组成
细菌群落组成主要受土壤pH影响（图2，S8），但不受菌根类型或其他环境变量的影响。而真菌群落组成则主要由菌根类型直接或间接通过降低EM栖息地土壤pH值决定（图S4）。除了毛霉菌和担子菌，大多数真菌高级分类群的相对丰度随着AM树优势而增加（图3）。SEM分析表明，EM真菌的相对丰度和丰富度驱动着细菌和腐生菌的相对丰度和富集（图2，S3）。Mantel测试和变化分区分析揭示了我们数据中的弱空间自相关（图S9）。
3. 微生物功能
植物营养获取策略影响微生物功能基因的相对丰度和组成。对真菌和细菌来说，栖息地菌根类型的差异均会引起CAZyme的显著差异。与AM地块相比，EM针叶林所显示出的差异更显著（图S3，S4）。EM优势程度的增加回减少微生物类群富集，而增加细菌多样性和真菌CAZyme基因含量 (图s 2A, S10)。细菌功能基因主要由土壤pH和针叶林的优势程度，菌根类型造成的影响较小。细菌与无机离子转运和代谢相关的OGs在EM优势地块丰度更高（图3）。与细菌情况不同，真菌OG组成与植物菌根类型显著相关（图2，S5），15N可以作为一个重要的土壤预测因子。真菌OG富集在EM优势地块中更高。在主要真菌OG中，无机离子转运和代谢随AM优势增加而增加，但是复制和重组则随EM优势增加而增加（图3）。
图3 不同植物营养获取策略和优势植被类型间微生物类群和功能基因的分布差异。AM优势地块和EM优势地块中（A）原核生物门水平（变形菌门）相对丰度（B）真核生物门水平相对丰度（C）细菌功能类群相对丰度（D）真菌功能类群相对丰度。
讨论
1. 微生物多样性
研究结果表明在不同植物营养获取策略尤其是菌根类型的生态系统中微生物种类和功能基因种类表现出的差异一致。包括土壤习居微生物在内的植物-土壤反馈系统导致不同生态进程间（如由树种和菌根类型不同引起的C和养分循环）的显著差异。特别是，我们发现非真菌真核生物和腐生真菌在AM生境中更丰富。这与AM生态系统中较高的分解速率一致，并且意味着EM真菌与自由生活的腐生菌，细菌和潜在的其他土壤微生物之间强烈的竞争性相互作用。与AM优势栖息地相比，EM优势栖息地（尤其是EM针叶林）中的分解有机体只有伞菌纲比较常见，这表明EM针叶林中会产生一些低质量的废弃物。
EM植物通常会积累具有高C/N比的难分解凋落物，其对土壤微生物组具有显著的直接影响。我们的模型表明，EM针叶植物是土壤C/N比增加和pH降低的主要驱动因素，这反过来又降低了细菌，古细菌，几个原生生物群和B/F比的富集。pH对土壤微生物富集的显著影响与先前报道以及本文分析结果一致。由于生理学，承受H+胁迫和营养分配的能力的差异，细菌分解途径在具有高pH和低C/N比的土壤中优于真菌。
细菌的功能和分类组成对pH以外的因素相对不敏感，真菌的功能多样性和分类多样性对菌根类型和植物多样性的响应最强。与大多数细菌相比，植物病原菌、AM和EM共生菌等生物营养真菌与活植物密切相关，因此表现出更强和更特异的植物相互作用。我们的分析还表明，菌根类型对土壤群落的影响可能很大程度上取决于其他植被参数，这反映在落叶和针叶树生态系统之间的巨大差异。
2. 功能基因
EM和AM生态系统中功能基因的总体分布相似，但木质素分解酶在EM生境中丰度和家族更为丰富，这归因于难降解凋落物的积累和具有强木质素分解能力的腐生伞菌的高丰度。虽然其他OGs的丰度大体相同，但EM和AM生态系统在细菌和真菌起源基因组成上存在很大差异。大多数基因家族是信号传递、细胞生长以及代谢和合成代谢过程的基础，而这些过程同样需要微生物组的各种功能组发挥作用。相反，细菌和真菌的降解和营养循环途径在气体（NH4、NO3、CH4）的排放以及胞内胞外生物高聚物降解方面表现出很大的差异。
AM生境中相对较大的B/F比值解释了与营养和C循环相关的细菌基因比例较高，这与AM生态系统中更动态营养循环是一致的。虽然我们的宏基因组学数据不能用来推断特定酶的产生和效率，但我们认为细菌和真菌的那些似乎时多余功能的途径可能会对土壤养分流通和碳循环产生不同的影响。与蛋白质组和转录组分析相结合的土壤过程原位测量将为深入了解植物养分获取策略之间的数量功能差异提供更深入的见解。总的来说，固氮植物和固氮细菌的相对丰度和多样性与细菌和真菌基因功能的多样性和组成呈弱相关，表明菌根类型和其他植被参数在驱动这些模式中的作用更为突出。
3. 病原菌和植物群落动态
根据Janzen-Connell的猜想，植物特异性拮抗剂的密度依赖性积累调节物种丰度，促进多样性。但是，EM真菌可能会干扰Janzen-Connell模式，与更多物种丰富的混合AM主导系统相比，这反映在通常的同种单显性EM主导系统中。EM可以借助促进支持同种植物个体的植物土壤反馈抵消密度依赖型的机制。与此相一致，最近的实验研究表明，与EM树相比，AM树从其相关的土壤微生物区系中经历了更大的拮抗作用。我们的代谢编码结果补充了病原体保护和抑制的观点，认为这是在EM系统中驱动植物-土壤正反馈的关键机制，表明假定的植物病原菌在AM主导的生态系统中平均多出2.6倍，尤其是在AM落叶林中（图1）。然而，对于这种机制对植物群落和多样性的影响却没有得到支持，因为EM基本面积对植物多样性的影响很弱，甚至在针叶树EM的情况下表现为正相关。其他机制在促进EM植物-土壤的积极反馈方面也可能很重要，例如广泛的共同EM菌丝网络重新分配养分和促进EM幼苗，EM真菌在N限制反馈环中捕获EM占优势的系统，从而加强EM共生的优势和必要性。我们的研究结果在一定程度上支持了后者的重要性，特别是在针叶树EM占优势的系统中，这些系统与较高的C/N和较低的B/F比、土壤δ15N和pH有关（图S3），以及代表优势真菌功能群的EM真菌的相对丰度（图S4）。尽管我们的研究结果需要更多的经验支持，但我们认为AM系统中的负反馈与EM系统中的正或中性土壤反馈相比，可能归因于四种非排他性机制：病原体对物种的特异性损伤，EM真菌对宿主的物理保护能力相对更强，不受外界环境的影响土壤环境，EM菌丝体对拮抗剂和竞争对手的直接拮抗作用，以及EM真菌对包括病原体在内的许多微生物群不利的酸性和低养分土壤条件的维持（图1，S3）。在混合EM-AM森林中，这些对比机制驱动着一系列积极、中性和消极的植物-土壤反馈，可能产生复杂的微位点，为各种物种提供再生生态位，并促进整体植物多样性。
4. 全球性影响
研究结果表明在区域尺度上，菌根类型可能是土壤微生物群落多样性和功能的最强预测因子之一，特别是在波罗的海地区的温带和北方森林生态系统中。在大的地理尺度上，植被参数对细菌和真菌组成的影响不太明显，这可能是由于气候变量和历史因素（包括扩散限制）的相互作用。从区域尺度到全球尺度的模拟结果表明，气候因素和土地利用在决定菌根类型分布方面起着额外的重要作用，EM植被可以提高土壤碳储量。另外，凋落物分解潜力被认为是全球菌根类型分布的关键驱动力。然而，对于我们所研究的温带/北方地区，我们的SEM模型表明，菌根类型影响土壤腐殖质、细菌以及与分解有关的基因的相对丰度和绝对丰度，反之亦然。方向性是很重要的，因为菌根真菌和病原菌都决定了植物在景观尺度上的成功定植，从而进一步塑造适合特定腐殖质类群的栖息地。局部影响变量，如土壤和植被参数以及更大尺度上的气候变量，对于全球变化对植被类型、土壤微生物多样性及其所控制的过程的潜在影响具有重要意义。EM植被在热带生态系统中分布不均匀，受降雨限制，可能受干旱和大气污染的影响最大。
综上所述，本研究结果表明，在温带和北方生态系统中，EM-AM植被之间的平衡变化可能会改变土壤微生物的结构和功能。然而，由于菌根类型在土壤化学和生态系统过程上的差异在低纬度地区有所减弱，因此植物养分获取策略之间的这些功能差异在多大程度上可以外推到北极和热带生态系统，目前还不清楚。我们需要设计实验来测试土壤pH和温度与菌根类型对土壤微生物群落结构和功能的影响以及这些影响在多大程度上是双向的。
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