科研 | Nat. Med.：宏基因组和代谢组分析揭示肠道菌群明显的结直肠癌阶段性特异表型
编译：北越城主，编辑：Emma、江舜尧。
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在大多数散发性结直肠癌病例中，肿瘤发生是一个多步骤过程，涉及基因组改变和形态学改变。越来越多的证据表明人类肠道微生物组与大肠癌的发展有关。研究者对来自616名接受结肠镜检查的不同阶段的结直肠癌患者进行了粪便宏基因组学和代谢组学研究。粪便宏基因组学发现了两种不同的微生物组显著升高。首先，Fusobacteriumnucleatum spp的相对丰度从粘膜内癌持续到更晚期的水平显着升高。其次，在粘膜内癌中共存的Atopobium parvulum和Actinomycesodontolyticus仅在多息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中显着增加。代谢组学分析表明，在粘膜内癌中支链氨基酸和苯丙氨酸显着增加，在多个息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中胆汁酸（包括脱氧胆酸盐）显着增加。大型队列多组学数据表明，微生物组和代谢组的变化是从结直肠癌发展的早期开始发生的，这在病因和诊断上具有重要意义。
论文ID
实验设计
宏基因组：Illumina HiSeq2500 platform，150bp双端测序，n=616
代谢组：毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)，n=406
样本分组：healthy control (normal and a few polyps,n=251)，MP (multiplepolypoid adenomas with low-grade dysplasia, n=67)，S0 (intramucosal polypoid adenoma(s) withhigh-grade dysplasia, n=73)，SI/II (stage I/II CRC, n=111)，SIII/IV (stageIII/IV CRC, n=74) 和HS (normal with a history of colorectalsurgery, n = 40)
实验结果
通过炎症刺激重新编程或“训练”的单核细胞源巨噬细胞(MDM)可以控制2型炎症期间呼吸道的免疫反应。
图1给出了616个受试者的分类学数据和406个受试者的代谢组学数据。富集Bacteroides的个体具有低丰度的Prevotella（图1a）。Megamonas在616个体中的118个检测出高丰度，而在其他个体中几乎检测不出来，表明了其分布的差异性，在之前的报道中，Megamonas不是欧洲人和美国人的肠道优势菌，但是在中国人中发现，表明它是亚洲人的特征菌。宏基因组测序检测到的人类基因组在各阶段的结直肠癌（CRC）个体中显著高于健康人。Bacteroides和Prevotella是影响肠型的关键因素，根据狄利克雷多项式混合模型，616位个体共分成四种肠型，其中一种受Prevotella支配，四种类型β多样性没有显著差异（图1b）。
丙酸盐和丁酸盐作为大肠中能量的主要来源，是丰度最高的两种代谢物。PCA分析，除了丙酸盐和丁酸盐，二氢尿嘧啶和尿酸的变化也很大。经过PCA分析，肿瘤阶段、肿瘤部位或性别与代谢物变化的相关性不大。
图1 粪便样本的宏基因组和代谢组特征。a. 菌属水平（上）和代谢物（下）组成；菌属水平（左）和代谢物（右）PCA分析
与健康对照相比，除了SI / II和SIII / IV外，我们发现MP和S0中的微生物组发生了变化，这在各个阶段之间都存在很大差异。S0，SI / II和SIII / IV个体的Firmicutes, Fusobacteria和Bacteroidetes中的许多物种主要升高，随恶性程度的增加而增加。Fusobacteria和 Bacteroidetes门的一些菌种随着恶性程度的增加（从S0、SI/II 到SIII/IV），相对丰度明显升高（图2a）。Bifidobacterium主要在S0阶段降低。随着CRC（结直肠癌）的进展，主要有两种显著性增加的模式：从低程度到高程度都增加的，只在低程度增加的。第一种模式的菌比如F. nucleatum、Solobacterium moorei、Peptostreptococcus stomatis、Peptostreptococcus anaerobius、Lactobacillus、Sanfranciscensis、Parvimonas micra和Gemella morbillorum。第二种模式的菌比如Atopobium parvulum、Actinomyces odontolyticus、Desulfovibrio longreachensis和Phascolarctobacterium succinatutens（图2b）。
此外，我们鉴定了与CRC新近相关的物种，其中Colinsella aerofaciens、Dorea longicatena、Porphyromonas uenonis、Selenomonas sputigena和Streptococcus anginosus在SIII/IV显著增加。与之前的研究一致, 乳酸盐生产菌Lachnospira multipara和 Eubacterium eligens在CRC阶段显著性降低。硫化物生产菌Desulfovibrio vietnamensis、D. longreachensis和Bilophila wadsworthia显著升高。总的来说，我们的发现许多微生物物种的改变可能与早期CRC发展有关。
与健康对照组相比，在至少一个阶段中，总共有65种代谢物显示出显着差异。其中胆汁酸，短链脂肪酸，氨基酸和中心碳代谢是人们关注的焦点，因为它们与肠道微生物群密切相关（图2c）。与健康对照相比，我们发现在MP组中脱氧胆酸（DCA）显著增加，S0组甘胆酸和牛磺胆酸显著增加，此外支链氨基酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸有所增加。异戊酸，一种通过微生物亮氨酸发酵得到的支链脂肪酸，从S0 到 SIII/IV 逐步增加（图2c）
由于MP中DCA升高，我们寻找了可能与此代谢物相关的物种。B. wadsworthia是唯一与DCA显著相关的物种 (图2d)，虽然在其它阶段，相关性系数是正的，但是不显著。B. wadsworthia已知需要在含有牛磺胆酸的培养基中生长，牛磺胆酸是DCA前体胆酸的共轭形式。B. wadsworthia是唯一与MP中DCA显着相关的物种（图2d）。
鉴于A. parvulum在 MP和S0组显著增加，并且据报道在炎症性肠病患者中通过与Streptococcus的高共现关系构成了一个产H2S细菌的网络中枢，因此研究了A. parvulum与其他菌的相关性。在S0组与Atopobium相关的菌，无论是属水平还是种水平的数量均显著增加 (图2e, f)。A. parvulum和A. odontolyticus、S. anginosus、S. moorei、G. morbillorum有很强的相关性，A. odontolyticus、S. anginosus、S. moorei、G. morbillorum在S0或后面的阶段丰度显著增加。Atopobium在CRC早期的增加，表明它可能对产H2S细菌有很强的影响。
图2 随着癌症进展具有明显阶段性的物种分类单元和代谢物
与健康对照相比，在至少一个阶段中，共有1,243个基因（KO基因）显示出显着升高和96个显着降低。由于粪便中的氨基酸浓度从S0显着变化（图2c），我们检查了微生物基因的丰度，以检查微生物在氨基酸代谢中的作用（图3a）。基因丰度的变化以路径表示法显示（图3b）。限制细菌生物合成和降解的途径模块是通过修改KEGG途径图或文献手动构建的。在差异最大的途径中，发现芳香族氨基酸代谢和产生硫化物的途径与CRC有关。苯丙氨酸和酪氨酸生物合成中涉及的基因显着升高，其中pheC被认为是将S0病例与健康对照区分开的得分最高的标记（图4b）。在分解代谢途径中，通过产生有毒乙酸苯酯引起苯丙氨酸降解的基因主要在MP中升高。色氨酸生物合成中涉及的基因在SIII / IV中显着减少。引起遗传毒性硫化氢的异化硫酸盐还原酶亚基A（dsrA）在SIII / IV中显着升高（图3b）。发现dsrA在许多减少硫酸盐的细菌中具有活性，包括Desulfovibrio spp.和Desulfovibrio piger在SIII / IV中明显较高。
图3 微生物中与CRC相关的KO基因和KEGG通路模块
大多数S0病变可通过内窥镜检查方法治愈，并且存在广阔的检测机会。为了研究肠道宏基因组学和代谢组学参数作为诊断指标的潜力，我们构建了随机森林和LASSO Logistic回归分类器，以区分S0和SIII / IV病例与健康对照。仅基于物种，仅KO基因，仅代谢物数据或这三种的组合构建了四种类型的模型。四个模型之间的分类潜力的比较导致组合模型在S0和SIII / IV的分类中均优于单个模型（图4b，c）。随机森林分类在ROC曲线和AUC曲线下面积分别为0.78和0.85，以分别检测出S0和SIII / IV CRC患者。
在S0 阶段，排在前面的marker主要是KO基因，包括pheC (编码环己二烯脱氢酶)。其他marker包括D. longreachensis、S. moorei、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和琥珀酸(图4b）。在SIII/IV阶段，排在前面的特征marker包括口腔厌氧菌，比如P. micra、P. stomatis、F. nucleatum 和 P. anaerobius(图4b）。
本研究收集了28例结直肠癌（SI/II和SIII/IV）患者手术治疗前和术后1年左右的宏基因组数据。切除肿瘤后，图2b中所示的22个物种中，P. stomatis、P. anaerobius、P. micra、P. uenonis和D. longicatena的相对丰度降低（图4d,e）。将这5个物种与HS组的粪便样本进行比较，没有发现显著差异（图4f）。主要的研究结果总结在图4a中。
图4 多阶段CRC进展中微生物动力学及它们的诊断潜力
目前对肠道生态系统与多步骤肿瘤发生之间关系的研究提供了有关CRC中微生物和微生物衍生代谢产物谱的信息。本研究结果表明，除了更高级的阶段外，MP和S0中的微生物组和代谢组发生了变化，各个阶段的变化非常明显。发现了两种物种升高的模式：第一种包括从早期开始的连续增加，而另一种仅在早期显示出升高。后一种模式是本研究的主要重点，考虑到肠道微生物组状态的改变可能使个体易患CRC。特别是，我们的研究结果表明，S0中的A. parvulum和 A. odontolyticus的丰度都增加了，这可能表明这些物种除了与晚期CRC的已知关联外，还参与了肿瘤发生中的初始阶段。
在本研究中，我们无法阐明腺瘤形成之前各阶段的任何潜在微生物参与以及微生物组和/或代谢组与肿瘤之间更详细的因果关系。因此，我们前瞻性地收集定期进行结肠镜检查的个体的粪便和组织活检样本，以用于将来可能具有纵向成分的微生物组分析。此外，有必要弄清个别CRC患者肠道微生物组与肿瘤分子特征之间的关系，以了解微生物组在CRC致癌作用中的作用。本研究不包括患有遗传性疾病或疑似遗传性疾病的病例。腺瘤仅限于常规型结直肠腺瘤，不包括锯齿状病变。最近，有报道称，后者可能与组织细菌有关。来自患有遗传性或疑似遗传性疾病的患者和患有锯齿状病变的患者的粪便和/或组织样本的元基因组学和代谢组学数据可能会阐明CRC肿瘤发生的其他方面。
总结
本研究观察了多步CRC进展过程中微生物组成，肠道菌群和代谢产物中基因丰度的动态变化。尽管尚不清楚这些物种和代谢物是否直接导致肿瘤发生，但肠道微生物区系的结构变化可能会导致致癌微环境发生变化。此外，本研究强调，CRC进展可能受整个微生物群的代谢输出以及与癌症相关的生物体的存在的影响。CRC从根本上说不仅是遗传疾病，而且还是微生物疾病。基于物种、KO基因、代谢物数据可以较好地对健康和CRC（S0、SIII/IV阶段）进行分类。
点评
本研究运用了宏基因组和代谢组分析方法相结合，在物种、基因、代谢通路、代谢物水平分析结直肠癌不同阶段的肠道菌群特征，可以较好地对健康和CRC（S0、SIII/IV阶段）进行分类，其结果对结直肠癌的预防和早期发现干预，以及对后期的治疗具有重要意义。