科研| Science亮点研究：首次在细胞中发现参与嘌呤合成的功能性代谢区室

编译：Winifred，编辑：谢衣、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

导读

40多年来，科学家一直在假设酶簇或“代谢区室”的存在，以促进细胞内的各种过程。宾夕法尼亚州立大学的研究人员首次使用新颖的成像技术与质谱相结合，直接观察到了产生嘌呤（功能最丰富的细胞代谢产物）的功能性代谢产物。“代谢区室”是由代谢途径的顺序酶组成的多蛋白复合物，被认为是细胞内的生物合成“热点”。然而，目前对其存在和功能进行实验证明仍十分具有挑战性。本论文的研究者使用代谢组学和气体簇离子束二次离子质谱（GCIB-SIMS）对单细胞进行原位三维亚微米化学成像，直接观察到了多酶复合物嘌呤体中的嘌呤从头生物合成过程，并首次发现嘌呤体包含9种协同作用的酶，可保证合成链条的高效性，并调节腺苷酸和鸟苷酸的合成比率。这些发现将对开发新的疾病治疗策略，破坏癌症进程具有重大意义。

论文ID

原名：Metabolomics and mass spectrometry imaging reveal channeled de novo purine synthesis in cells

译名：代谢组学和质谱成像揭示了细胞中嘌呤的从头合成路线

期刊：Science

IF：41.037

发表时间：2020年4月

通讯作者：Nicholas Winograd, Stephen J. Benkovic

作者单位：美国宾夕法尼亚州立大学

背景介绍

从头嘌呤生物合成（DNPB）是一种高度保守的能量密集型途径，可与嘌呤的补救过程相协调，以维持嘌呤水平，使得细胞在不同营养和进化环境的要求下保持细胞的增殖，存活和代谢（图1A）。

包括人类在内的高级生物中，从头合成途径是由的6种酶与磷酸核糖焦磷酸（PRPP）一起进行的，然后通过10个连续步骤将其转化为次黄嘌呤核苷酸（IMP）。IMP是代谢的一个分支点，随后可通过四种酶进而转化为腺嘌呤核苷酸（AMP）或鸟嘌呤核苷酸（GMP）。而游离嘌呤碱基可以与PRPP结合，通过补救酶--次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸磷酸核糖基转移酶（HGPRT）和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）的作用再生各自的单核苷酸（图1A）。

研究者之前通过荧光显微镜观察到多种DNPB酶显示部分共定位化，且为胞质点状结构，同时其大小，数量和组成均不相同。同时发现这些动态结构中的大部分结构（即嘌呤体）非常靠近线粒体，而其他部分则驻留在微管上，并向线粒体定向运动。

线粒体附近的嘌呤体被认为是构成活性DNPB 的“代谢区室”，但是这种多酶复合物的动态性和脆弱性阻碍了它们的体外重建。此外，由于瞬时过表达和荧光成像方法的局限性而引入的失真现象，使人们难以确定完整的酶和辅助蛋白的组成，进而无法阐明其在复合物中的相对化学计量，并确定功能状态嘌呤体中酶的含量。

实验方法和结果

1. 细胞模型及数学模型的构建

研究者在补救合成和从头合成两种途径的中间体和末端核苷酸中分别掺入[¹⁵N₄]标记的次黄嘌呤或[¹⁵N]标记的甘氨酸（Gly），以检测两种合成途径在细胞内的发生（图1A）。结果如图1 B，C所示，在嘌呤缺乏（P -）培养基中，细胞中5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸（AICAR）的丰度更高，同时含有[¹⁵N]标记的AMP/GMP含量更高，这意味着细胞内发生了大量的从头合成。相反，[¹⁵N₄]标记的AMP / GMP只在嘌呤富集（P +）培养基的细胞中被发现，因而可以认为这些细胞只能进行补救合成。因此，研究者最终使用高DNPB表达的嘌呤耗尽型HeLa细胞作为接下来研究嘌呤体形成及代谢的模型。

同时研究者开发了一种数学模型，预测在不存在DNPB代谢区室的情况下所期望的同位素标记的分布，然后通过进行体内同位素掺入实验以检测预测结果。

如图1D，研究者首先在细胞培养基中加入被[¹³C₃、¹⁵N] 标记的色氨酸（Ser），这些Ser随后被线粒体通过线粒体丝氨酸转运蛋白（SFXN1）内化，并经历丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）和亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环水解酶（MTHFD）等一系列酶的不同作用从而构成线粒体内的一碳代谢，并产生甘氨酸Gly和甲酸盐。这些产物离开线粒体后通过酶甘氨酸酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶（GART）和氨基咪唑氨甲酰转移酶（ATIC）的作用，从而进入DNPB等胞质代谢途径中。

接下来，研究者建立了一个零假设模型：假设该路径的10个步骤（从PRPP开始并导致IMP形成）均彼此独立；所有中间体均与各自的胞质池完全平衡；所有酶、辅酶、底物和辅助因子在胞质溶胶中均匀分布，即在线粒体附近没有嘌呤体的形成和定位。

如果假设该途径中掺有均匀同位素标记的Gly（1-x）和甲酸盐（1-y），该模型则可以预测DNPB途径中间体和终产物中的同位素异构体分布。如图1E所示，如果x和（1-x）分别代表未标记和标记的Gly，y和（1-y）分别代表未标记和标记的甲酸盐（来源自[¹³C₃、¹⁵N]Ser的线粒体代谢），那么已标记的Gly和甲酸盐进入DNPB途径的过程便可以用数学方法描述。

如图1F，G所示，通过观察DNPB途径中Gly与甲酸盐结合的中间产物（即磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰胺（FGAR），磷酸核糖基氨基咪唑琥珀酰胺（SAICAR），AICAR）的同位素碎片，便可以推算出出原始Gly (1–x) 和甲酸盐 (1–y)的同位素含量，同时可以预测5-甲酰胺基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸（FAICAR）和所有下游核苷酸中预期的同位素异构体分布。此外，研究者发现[¹³C₃、¹⁵N] Ser特别适用于生成由未标记和标记的Gly引起的独特的同位素异构体，因为它们之间没有重叠，因此可以计算每个中间产物和最终产物的新生成合并物。

图1 在通路上调后研究HeLa细胞中DNPB的理论模型

2. 线粒体附近的嘌呤体引导新的嘌呤生物合成

数学模型将DNPB设定为简单的扩散和传递过程（图1 E），并给出以下预测：

（i）IMP和所有下游核苷酸必须具有+ 3，+ 4和+5种相同的同位素异构体分布，因为在FAICAR形成后没有进一步的同位素掺入；

（ii）在实验过程中产生的DNPB中间体和末端核苷酸中标记的Gly和甲酸盐富集应该相同（图S1，B和C）。

为了验证这些预测，研究者进行了同位素掺入实验，将细胞在含有特定浓度的[¹³C₃、¹⁵N] Ser培养基中培养4h，然后使用LC/MS检测细胞代谢产物，以观察同位素标记的Gly和甲酸盐在线粒体内的生成以及在嘌呤中的掺入。

实验结果与模型预测相反，IMP中的两个中间产物（+3和+5）的丰度与AMP和GMP中的显著不同（图2 A），表明IMP和AMP/GMP具有不同的同位素分布。为了了解这种差异的来源，研究者使用每个独立实验中观察到的FGAR和SAICAR同位素异构体分布，如模型所描述的那样计算了IMP中的完整同位素异构体分布，并将其与IMP和所有下游核苷酸的异构体分布进行了比较。分别是黄嘌呤单磷酸（XMP），琥珀酰-AMP（SAMP），AMP和GMP。而观察到的IMP和XMP的分布与模型预测的同位异构体分布相匹配（图2 B），AMP，SAMP和GMP均显示出与预测值相比显著不同的同位异构体分布（图2 C）。因此推测，IMP及其前体底物FGAR和SAICAR是从相同的底物胞质库（Gly和甲酸）合成的，并且相对于用于AMP和GMP合成的底物库具有不同的同位素富集。

接下来，研究者使用在AMP和GMP中观察到的同位素异构体分布，计算了通道途径的源底物中同位素富集的百分比。相对于通过甘氨酸和甲酸盐通过非通道途径合成的新生成的通道化DNPB产物AMP / GMP，其同位素富集度高于IMP。与IMP相比，新合成的AMP / GMP的Gly富集度提高了约10％（图2 D），甲酸富集度提高了15％至20％（图2 E）。得出结论，AMP和GMP的合成以高度引导的方式完成，从而防止了通路中间体与其大量胞质池平衡。相对于IMP，AMP/GMP中同位素的富集度更高，表明“活性” DNPB代谢区室在物理距离上很接近，或者酶与线粒体代谢物转运蛋白之间可能是直接结合的。

为了检验这一解释，研究者用麦考酚酸（MPA）使细胞中毒，IMPDH抑制会导致IMP从嘌呤体中积聚和泄漏，从而导致从两个独立途径产生的IMP相互混合。如所预期的，由于通过通道的嘌呤体强迫释放IMP，用抑制剂处理细胞导致IMP的大量积累（约12倍）（图2 F）。经MPA处理后，在AMP和IMP中观察到的标记甲酸盐富集程度相似（图2 E）。

同样，当将同位素标记的Ser的浓度增加4倍后，会导致标记的甲酸盐在细胞质中均匀分布。在这些条件下，GMP和AMP（通过通道途径合成）以及中间体XMP和IMP（通过非通道途径合成）显示出相似的甲酸盐同位素富集。这种邻近导致被“活性”嘌呤体优先捕获Ser衍生的甘氨酸和甲酸盐，用于通道DNPB，其中限制了嘌呤体合成的中间体与其各自的大量胞质池的平衡。另一方面，检测到的IMP必须来自第二个扩散底物途径或不完全的嘌呤体。因此，“活性”DNPB代谢区室代表了位于线粒体近端的9种酶的组装，能在14个高度通道化的步骤中催化PRPP向AMP和GMP的转化（图2G）。这也印证了先前的报道，即嘌呤体沿微管定向迁移，以促进线粒体产生代谢产物，Gly，Asp和甲酸。

图2 HeLa细胞通过线粒体附近的酶显示出高度通道化的DNPB。

3. 高分辨率GCIB-SIMS成像在单细胞水平上探测生物化学的应用

质谱成像（MSI）已成为在各种生物系统中定位内源性和外源性化合物的强大工具。研究者使用GCIB-SIMS技术，研究了冷冻的水合单层HeLa细胞中嘌呤生物合成途径中间体和末端核苷酸的完整分子离子的胞质分布，该技术可以在不造成化学损害的情况下进行高质量离子检测。

用于多层原位化学分析，研究者使用高分辨率GCIB-SIMS（其簇状尺寸为(CO2)n+ (n > 10,000)，聚焦点直径为1mm）生成了一组质谱对应于每1 mm×1 mm×300 - 400 nm体素，覆盖每层约256 mm×256 mm的总的横向视野（图3 A-D）。分析可得，从横向层的每个像素获得的光谱不受相邻像素执行的分析的影响。

随后在连续的分层扫描过程中，穿过单元的深度分布图表明，在分析上层时较深的层保持不受干扰（图3C）。然而GCIB-SIMS扫描细胞会产生一组复杂的质谱图，因为可电离的代谢物会产生几种假分子离子，盐加合物和碎片离子，给图谱的解读带来了许多阻碍（图3D）。

在进一步分析嘌呤生物合成途径之前，已经鉴定出主要构成目标代谢物的独特峰，而对其他化合物的干扰最小。研究者通过分别在P +或P–条件下生长的细胞中掺入同位素标记的次黄嘌呤、Ser和Gly来验证峰分配（图3 E-H）。在MSI处理之前，先向细胞补充稳定同位素标记的[¹⁵N] Ser / [¹³C] Gly或[¹⁵N₄]次黄嘌呤（图3 F，G）。处理12至14小时，以确保足够的富集，从而可以通过GCIB-SIMS检测所有同位素。结果显示通过SIMS测量的同位素掺入百分比与掺入12小时后通过细胞提取液的高分辨率LC / MS在批量分析中获得的百分比一致（图3 H）。

图3 通过原位GCIB-SIMS鉴定细胞内嘌呤核苷酸的独特分子离子

4. GCIB-SIMS原位成像捕获代谢产物

从荧光成像结果可以推测，嘌呤体是直径约0.2到0.9 mm的大致球形多蛋白组装体，因此焦距为1 mm的3D分子扫描GCIB特别适合捕获活性功能性嘌呤体。如果由于嘌呤体的活性DNPB而引起的DNPB途径的代谢通道，将导致途径中间产物和靠近作为生物合成热点的酶复合物的末端核苷酸的局部浓度更高。研究者利用此功能来识别和表征嘌呤体。在执行MSI之前，将HeLa细胞在贫嘌呤的培养基中生长，并补充[¹⁵N] Ser进行同位素富集12至14小时。由于线粒体区隔将Ser转化为Gly，以期线粒体相关的DNPB代谢产物在空间上具有更高的同位素标记中间体和终产物核苷酸浓度。通过LC / MS进行的大量代谢组学推算表明，只有在甲酰THF利用率有限的情况下，才能有效地引导和积累AICAR。因此，将具有高浓度的¹⁵N标记的DNPB中间体AICAR的细胞质位点，则被用来作为速冻HeLa细胞中活性嘌呤体的报道因子。

总离子光谱图像用于定义每一层中的细胞边界（图4 A）。从细胞的总离子光谱中，选择对应于标记的AICAR的峰（m / z 338.05，Dm / z 0.01）以获得其在每一层中的空间分布（图4 B-D）。独立分析每一层，并从分析中删除每个像素的最高强度不足30％或出现在定义的单元边界之外的像素。AICAR显示出不均匀的分布，具有分离的，分离的高浓度体素（图4 E），每个体素中有≥3个AICAR离子。该结果表明，相对于整个细胞体积中均匀分布的预期丰度，每个体素的AICAR分子丰度高300到1000倍。研究者同时观察到每个细胞的平均密度为10至30个富含15N的AICAR像素（图4 F）。

为了分析标记的AICAR像素的化学成分，在单个视场中从所有单元格的顶部两到三层生成了所有此类像素的累积质谱图。然后分析下游途径代谢产物AMP，ATP和GTP的同位素富集。在每一层中，相对于随机细胞像素，[¹⁵N] AICAR像素显示出下游最终产物核苷酸ATP的¹⁵N/¹²C比升高（图4 G）。在所分析的每一层以及执行的所有重复实验中，始终可以看到标记的AICAR像素中ATP的⁵N/¹²C比率更高（图4 G）。这一趋势证实，在P– 细胞中观察到的富集是由于主动的DNPB通道通路而产生的特定信号。

最终推测，由于脱氧GTP对胞质信号中相同峰的贡献，未观察到与来自GTP的分子离子相对应的峰具有相似的相关性。同样，由于质量分辨率低，无法观察到AMP中¹⁵N标记的富集，这导致AMP +1峰与未标记的IMP重叠，从而干扰了[¹⁵N] AMP的精确估算。同样，在任何对照实验中都未观察到标记的AICAR和ATP之间的这种相关性，即ATIC CRISPR敲除HeLa细胞（缺乏酶来催化DNPB中间体AICAR向IMP的转化）（图4 H），P + [¹⁵N] Ser（没有可观察到的DNPB通量的细胞）（图1C）和P– [¹³C] Gly（带有泄漏的低效DNPB通道）（图4 I）。研究者的结果验证了之前的假设：嘌呤的产生被定位在生物合成“热点”，这与细胞内的“活性”嘌呤体代谢区室是一致的。 

图4 结合GCIB-SIMS和同位素标记鉴定单个细胞中通道化DNPB的基因座

总结

本文研究者首次发现DNPB途径是由至少9种酶组成的代谢区室进行的，这些酶协同作用将途径通量提高约7倍，同时研究者提出了嘌呤体的功能定义，即“活性” DNPB代谢区室，并利用高分辨率GCIB-SIMS方法验证了嘌呤体的物理位置位于线粒体附近。本研究同时揭示了嘌呤体代谢区室对人体健康的重要性，及其在嘌呤需求量高的侵袭性癌症中的作用，这在为研究新型癌症治疗方法打开了大门，比如设计可以破坏嘌呤体与线粒体结合的分子以阻碍癌症进程。

原文网址：https://dx.doi.org/10.1126/science.aaz6465