科研 | Food Chem：长裙竹荪子实体采后形态发育过程的定量蛋白质组学和代谢组学分析（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
通过定量蛋白质组学和代谢组学分析，我们系统地研究了采后桃形和成熟期长裙竹荪子实体的差异。在成熟子实体中我们共鉴定出951个差异表达蛋白，571个上调，380个下调；此外，我们还筛选出了173个上调和165个下调差异丰度代谢物。综合蛋白质组和代谢组分析结果表明，在长裙竹荪子实体成熟过程中，甘油磷脂被水解并急剧下降，葡聚糖降解上调，几丁质降解和合成同时增强，蛋白质主要通过分解代谢，伴随着剧烈的物质代谢，能量的产生通过上调TCA循环和氧化磷酸化而增强；此外，成熟长裙竹荪子实体中抗氧化物质的合成和过氧化物的分解也有所增强，这些组学分析提供了高通量数据，揭示了采后形态发育的变化。
论文ID
实验设计
1、利用TMT蛋白质组学方法对桃形期和成熟期长裙竹荪进行了定性和定量蛋白质组学比较分析；
2、通过GO注释和分析，评估DEPs对生理过程的影响；
3、通过对DEGs进行了功能富集和聚类分析研究DEPs的关键功能；
4、利用UPLC-MS定性和定量比较DEPs对长裙竹荪子实体和成熟子实体代谢产物的影响；
实验结果
1. 蛋白质鉴定和定量
我们采用基于TMT的蛋白质组学方法，对桃形期和成熟期长裙竹荪进行了蛋白质组学比较分析，从桃形和成熟子实体中鉴定出3933个蛋白。我们将蛋白的表达丰度归一化到桃形期样品中，并设置fold change≥1.3(or < 0.667)和p值≤0.05的阈值来测定DEPs，共鉴定出951个差异表达蛋白，其中上调蛋白571个，下调蛋白380个(图1A)。
2. DEPs的功能注释
DEPs在细胞中的分布可以初步了解桃形子实体与成熟子实体生理活动的空间变化，因此，我们进行了DEPs的亚细胞定位分析。结果表明，571个上调蛋白主要分布于细胞质(24.5%，140个蛋白)、线粒体(21.0%，120个蛋白)和细胞核(20.8%，119个蛋白)。其中，380个下调蛋白主要分布于细胞核(38.4%，146个蛋白)、线粒体(21.6%，82个蛋白)和细胞质(18.4%，70个蛋白)，详细信息如图1B所示。这些结果清楚地表明，与下调蛋白相比，上调蛋白在细胞膜、细胞质和线粒体中的比例更高，而上调的蛋白位于细胞核内的比例远低于下调的蛋白。上调蛋白和下调蛋白亚细胞定位的差异表明，长裙竹荪成熟后，其核内的生理活性大大减弱，核外活性明显增强。
为了评估DEPs对生理过程的影响，我们进行了GO注释和分析。在“生物过程”类别中，DEPs主要分为“代谢过程”(178个上调，130个下调)、“单一有机体过程”(129个上调，52个下调)和“细胞过程”(66个上调，104个下调)(图1C)，除“细胞过程”外，所有分类中上调蛋白均多于下调蛋白；此外，15个上调蛋白和无下调蛋白被注释为“对刺激的反应”，这可能表明长裙竹荪子实体在成熟过程中面临更多的胁迫。
在“细胞成分”类别中，DEPs主要分布在“膜”(38个上调，7个下调)，“细胞”(28个上调，87个下调)，“细胞器”(17个上调，66个下调)和“高分子复合物”(9个上调，71个下调)。结果表明，从桃形开始，长裙竹荪子实体的膜结构增强，其他细胞结构减弱，特别是“大分子复合体”，这与亚细胞定位结果一致:在“质膜”中有61个蛋白上调，只有19个蛋白下调。
在“分子功能”方面，上调的DEPs主要分为“催化活性”(221)和“结合活性”(129)；下调DEPs最多的术语具有“约束力”(122)、“催化活性”(89)和“结构分子活性”(47)。其中，“催化活性”一词的表达量最高，表明子实体成熟需要大量的酶；47个下调而未上调的蛋白注释为“结构分子活性”，这与DEPs在“细胞成分”类别中的分布一致:下调蛋白231个，上调蛋白94个。值得注意的是，21个和11个上调但没有下调表达的蛋白质分别注释了术语“运输活动”和“抗氧化活性”，这表明这两个活动是重要的长裙竹荪子实体的形态伸展。
图1 桃形和成熟长裙竹荪子实体差异表达蛋白(DEPs)的统计和功能注释
A不同褶皱变化的DEPs总结；B DEPs的亚细胞位置；C DEPs的GO分类。
3. DEPs的功能富集及聚类分析
为了进一步研究DEPs的关键功能，我们对DEGs进行了功能富集和聚类分析，根据DEPs的差异表达倍数将其分为四分位数(fold change，成熟长裙竹荪vs桃形长裙竹荪)，称Q1 ~ Q4：Q1, fold change ≤1/1.5；Q2, 1/1.5< foldchange ≤1/1.3；Q3, 1.3< foldchange ≤1.5)；Q4, fold change>1.5，然后对每个Q组的GO、KEGG和蛋白结构域进行富集分析，将结果聚类绘制热图。
下调DEPs的GO项富集主要与翻译有关。在“生物过程”类别中，Q1和Q2均富集了“肽生物合成过程”(图2A)。在“细胞成分”类别中，“核糖核蛋白复合物”、“核糖体”和“核糖体亚单位”在Q1和/或Q2中均占过多比例(图2B)。相应的，Q2中“分子功能”类的术语“核糖体结构组成部分”和“7S RNA结合”也得到了丰富(图3C)。这些结果表明，在长裙竹荪成熟过程中，核糖体成分明显减少，减缓了肽的生物合成过程。
在Q3和Q4中富集(上调)的GO项主要与呼吸有关。在“生物过程”类别中，Q4中富集的氧化石墨烯术语均参与了离子跨膜转运过程(图2A)；在“细胞成分”范畴，DEPs上调主要富集在细胞膜和ATP合酶复合物中(图2B)，值得注意的是，富集的ATP合酶复合物都位于细胞膜上。在“分子功能”方面，上调的DEPs主要与离子跨膜转运体活性、结合活性(包括黄素腺嘌呤二核苷酸、吡哆醛磷酸、铁离子、血红素)、作用于糖基和碳碳键的水解酶活性、氧化还原酶活性有关(图2C)。这些结果表明，成熟子实体以呼吸链为核心、氢离子转移为主要过程的生理活动显著上调，并伴随上游供能体的水解(碳水化合物和脂肪)和下游能量(ATP)的产生。
此外，我们进行KEGG富集分析，以确定翻译下调和呼吸活性上调的潜在调控途径。对于下调的DEPs，“核糖体”和“甾体生物合成”富集于Q1/Q2；对于DEPs上调，在Q3和Q4中富集了11条通路(图2D)。这些途径参与了碳水化合物(“抗坏血酸和醛酸代谢”，“戊糖和葡糖醛酸的相互转化”)，蛋白质(“氮代谢”，“精氨酸和脯氨酸代谢”，“色氨酸代谢”，“谷胱甘肽代谢”)和脂类(“过氧化物酶体”)的代谢。所有这些通路都是富集的“氧化磷酸化”通路的上游。这些结果与氧化石墨烯富集的结果高度一致，并阐明了长裙竹荪子实体在成熟过程中变化的一些细节。另外，Q3中富集“次生代谢产物生物合成”和“抗生素生物合成”两条途径，表明长裙竹荪子实体具有较高的抗生素活性。
DEPs的蛋白结构域富集分析证实了上述结果。在Q1和Q2中，大部分富集域与翻译功能相关(图2E)；在Q3和Q4中，这些富集的蛋白结构域主要参与碳水化合物和脂类的降解、氧化还原反应、谷胱甘肽代谢和过氧化物酶体。
图2 桃形和成熟长裙竹荪子实体差异表达蛋白(DEPs)的功能富集及聚类分析
A GO“生物过程”富集DEPs；B GO“细胞成分”富集DEPs；C GO“分子功能”富集DEPs；D KEGG通路富集DEPs；E DEPs蛋白结构域的富集。
4. 代谢物鉴定和定量
我们利用UPLC-MS分析和定量比较了DEPs对长裙竹荪子实体和成熟子实体代谢产物的影响，鉴定出569个代谢产物。为了研究桃形子实体与成熟子实体之间的区别，我们对完整的代谢数据集进行了多元分析。无监督主成分分析(PCA)显示，对于第一个成分(PC1为63.9%)，两个阶段得到了彻底的区分(图3A)。通过正交信号校正和偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，两组样本的差异更明显(图3B)。OPLS-DA模型的R2 X (cum)、R2 Y (cum)、Q2(cum)分别为0.751、0.998、0.994，表明OPLS-DA分析的可靠性，这些结果表明，两个阶段的子实体之间存在着显著的代谢多样性。
根据OPLS-DA分析（表S2）中投影值（VIP>1.0）和p值（p<0.05）的变量重要性，我们筛选了桃形和成熟长裙竹荪子实体之间差异丰富的代谢物，其中鉴定出的338种代谢物差异显著，桃形子实体中含量较高的代谢产物有165种，成熟子实体中含量较高的代谢产物有173种。
图3 桃形和成熟长裙竹荪子实体中差异丰富代谢产物的分析
A PCA分析；B OPLS-DA分析；C 差异丰富代谢物的分类。
5. 差异丰富代谢物的分类
以“甘油磷脂”分类最多，成熟子实体中有42个代谢产物下调，11个代谢产物上调(图3C)。这一结果表明，长裙竹荪子实体成熟过程中抑制了甘油磷脂的合成或加速了甘油磷脂的消耗。总体上呈下降趋势的代谢物分类包括：“脂肪酸及其衍生物”(11个上调，22个下调)、“萜类”(5个上调，18个下调)、“亚麻酸及其衍生物”(0个上调，11个下调)和“二十烷类”(1个上调，8个下调)。值得注意的是，这些分类都是脂类和类脂分子的亚类，而在我们前期的研究中，成熟子实体总脂含量(9.15 g/100 g干重)显著高于桃形子实体(7.41 g/100 g干重)，主要原因可能是在代谢组分析中没有提取和分析甘油三酯等非极性脂质分子。
而在“氨基酸代谢组学”分类中我们发现了39个上调的代谢产物和8个下调的代谢产物，表明在长裙竹荪子实体成熟过程中，蛋白质发生了降解。在“碳水化合物代谢组学”(21个上调，6个下调)和“有机酸及其衍生物”(14个上调，3个下调)分类中，DAMs整体呈上升趋势。有趣的是，这些上调的代谢产物在长裙竹荪成熟过程中都是初级代谢产物。有一种可能是，随着长裙竹荪的形态发育，子实体中的物质必然被降解为初级代谢物，重新合成为新的大分子。这些结果与之前的研究结果一致，表明长裙竹荪子实体成熟后总蛋白、水溶性多糖和粗纤维均显著降低。
6. 主要的DAMs
为寻找最具代表性的DAM，我们根据质谱信号强度计算各DAM的丰度。结果表明，“甘油磷脂”(25.6%)、“亚麻酸及其衍生物”(18.7%)、“脂肪酸及其衍生物”(14.0%)、“碳水化合物代谢组学”(5.5%)和“氨基酸代谢组学”(4.9%)是桃形子实体中含量最高的5个代谢类。成熟期代谢产物丰度变化较大：成熟期产子实体中代谢产物丰度排名前5位的是“碳水化合物代谢组学”(24.9%)、“亚麻酸及其衍生物”(13.7%)、“脂肪酸及其衍生物”(9.7%)、“甘油磷脂”(9.5%)和“有机酸及其衍生物”(9.0%)。在所有代谢物分类中，“甘油磷脂”是丰度下降最大的代谢物分类，为63.1%，“碳水化合物代谢组学”代谢产物分类的丰度增加最大，增加了3.5倍(图4A)。
在甘油磷脂分类中，成熟的长裙竹荪子实体中磷脂酰胆碱(PC)下降幅度最大(85.8%)，磷脂酰丝氨酸(PS)下降幅度最小(27.1%)(图4B)。在桃形长裙竹荪子实体中，“甘油磷脂”含量最高的3个分子为“PC(18:2(9Z,12Z)/18:2(9Z,12Z))”,“LysoPA(0:0/18:2(9Z,12Z))”、“PC(18:1(11Z) / 18:3(6Z,9Z,12Z))”和“PE(18:2(9Z,12Z) /18:2(9Z,12Z))”。结果表明，成熟的长裙竹荪子实体中这3种物质的含量均显著下降，fold change分别为0.14、0.07和0.11，因此，在成熟子实体中，其他三种分子的磷脂含量最高：“GlcCer(d16:2(4E,6E)/20:0(2OH))”、 “PE(18:2(9Z,12Z) /18:2(9Z,12Z))”和“PE(P-16:0/20:4(5Z,8Z,10E,14Z)(12OH[S]))”。其中，成熟子实体中磷脂酸含量增加251.4%；“PA (20:2 (11 z,14 z) / 18:2(9Z,12Z)”增加了725.84倍，在所有代谢产物中丰度变化最大。
在“碳水化合物代谢组学”分类中，dulcitol是最丰富的代谢物，在长裙竹荪成熟过程中，其丰度急剧增加了5.37倍，在分类中丰度增加最大(图4C)。褐藻酸丙二醇、(S)-Multifidol2-[apiosyl-(1->6)-glucoside]和3-甲基戊二酸是代谢产物中变化幅度最大的；与桃形期相比，成熟子实体的丰度分别增加了77.92、38.56、13.88和10.11倍；果实中L-核酮糖的丰度增加幅度最大，在成熟子实体中增加了5.91倍；在成熟的长裙竹荪子实体中，维生素C前体物质L-gulonic gamma-lactone的丰度增加了3.72倍，相应地，L-抗坏血酸的丰度也增加了2.39倍。
除了上述的DAM，其他重要的代谢物也被筛选出来了。由于VIP值代表了DAM对两组差异的贡献，所以表S3列出了VIP值最高的25座DAM。在这些DAM中，有人参皂苷Rh3和葫芦酸B等具有重要生物活性的分子，其在成熟的长裙竹荪子实体中的丰度降低(倍数变化分别为0.393和0.370)，暗示桃形长裙竹荪子实体可能具有更强的功能活性。作为极其重要的代谢中间体，成熟子实体中柠檬酸的丰度增加了61.3%，说明成熟期的代谢强度显著高于桃形期。
另一个值得注意的现象是，代谢物丰度的变化与碳原子的数量有关。所有DAM的统计结果显示，在碳原子<15的代谢物中，上调代谢物的数量大于下调代谢物的数量。而对于含有16个碳原子的代谢物，更多的代谢物被下调(图4D)。这一结果可能表明，在长裙竹荪子实体的成熟过程中，分解代谢占主导地位。
图4 桃形子实体与成熟长裙竹荪子实体差异丰富代谢物的代表性分类及其差异
A 主要代谢物分类丰度的比较；B 甘油磷脂丰度的比较；C 碳水化合物代谢组学比较；D 不同碳原子数代谢物的比较；E 差异丰富代谢产物的富集KEGG通路分析。
图5 抗氧化活性测定结果
A 谷胱甘肽含量(谷胱甘肽)；B谷胱甘肽转移酶活性；C丙二醛(MDA)含量；D过氧化物酶(POD)活性；E总抗氧化能力(T-AOC)。
结论