科研 | Cell：生酮饮食改变肠道菌群导致肠道Th17细胞减少
编译：草重木雪，编辑：Emma、江舜尧。
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极低碳水、高脂肪生酮饮食(KDs)会显著改变能量代谢利用，从而提高循环中的酮体。然而，目前尚不清楚这些化合物对宿主-微生物组的作用机制。本研究对住院病人8周粪便样本的宏基因组和代谢组学进行了分析，发现KDs饮食期间病人肠道菌群结构和功能发生了显著变化。随后在小鼠中进行的梯度饮食实验证实KDs相较于高脂饮食（HFDs）可重复地消耗双歧杆菌。通过体内体外实验发现酮体可选择性抑制双歧杆菌生长，最后，通过单定植以及人菌群移植到无菌小鼠，发现KD相关菌群降低了肠道Th17细胞水平。说明KDs以不同于HFDs方式改变人类和小鼠肠道菌群，以及“跨界化学对话”对于调节宿主应对饮食干预的重要性。
论文ID
实验设计
研究者在人样本中研究KD饮食（5%CHO，15%蛋白质，80%的脂肪）与正常饮食（50%CHO，15%蛋白质，35%的脂肪）差别，后基于鼠动物模型上比较正常饮食、低脂饮食、高脂饮食以及KD饮食所带来的不同影响。通过菌群移植以及单定植无菌小鼠来探究KD饮食是否通过肠道菌群产生作用，最后通过代谢物以及菌群、免疫相关研究建立KD-双歧杆菌-Th17的联系（下图所示）。
实验结果
1、生酮饮食可重复地改变人的肠道菌群
研究者对17名成年超重或I类肥胖非糖尿病男性进行了交叉研究，参与者首先给予4周正常饮食(50%碳水，15%蛋白质，35%脂肪)，然后是4周KD饮食（5%碳水，15%蛋白质，80%的脂肪）（图1A），血浆中酮体含量随之升高（图1B）。在每个饮食期的最后一周收集每日粪便样本。在两次粪便收集期间，受试者均处于类似的轻度能量负平衡状态。16S-seq显示，两饮食之间的肠道菌群发生了显著变化(图1C及S1A；表S1)，包括放线菌、拟杆菌和厚壁菌门丰度变化（图1D）。对来自两个饮食组的配对粪便样本进行宏基因组测序发现KD饮食后部分双歧杆菌减少(图2A和2B；表S2)。通过1H NMR对粪便代谢组进行全局分析，发现BD和KD期粪便代谢产物的分布显著分离（图1F；S1B；表S3）。在短链脂肪酸水平(图1G)或细菌载量方面，没有观察到任何显著差异(图1H)。
图1 生酮饮食相对于等热量控制饮食改变了人类肠道菌群落结构
(A)分别在基线饮食(BD)和生酮饮食(KD)阶段的每日饮食组成，以卡路里百分比表示。（B）在所有17名研究参与者的KD期间，酮体乙酸乙酯(AcAc)和b-羟基丁酸(βHB)的血浆水平显著升高(***p <0.001；配对t检验)。（C）在两个饮食阶段之间的费尔欧几里得距离的PCo1上，研究参与者的肠道菌群落结构可重复变化。（D）KD改变了人肠道菌群中主门的相对丰度。(E)丰度受KD显著影响的属的变化率。（F）17名研究参与者BD和KD饮食阶段之间粪便代谢产物1H NMR谱的OPLS-DA评分图。OPLS-DA模型采用7倍交叉验证方法进行验证；R2值表示预测能力(R2 > 0.5表示模型稳健)，Q2 > 0.4表示模型有效。(G)人粪便短链脂肪酸(SCFAs)的气相色谱-质谱(GC-MS)分析未显示BD(15个样本)和KD(15个样本)饮食阶段的SCFA浓度差异。使用配对t检验对每个SCFA进行统计分析。(H)两个饮食阶段的粪便DNA含量差异不显著(ns，不显著；配对t检验)。
图2 宏基因组测序显示，研究者的人类生酮饮食双歧杆菌物种丰度下降
（A）在研究者的人类研究中，对17个受试者的生酮饮食(KD)和基线饮食(BD)阶段进行比较，显示50个最丰富物种的变化。细菌种类按平均变化的大小和方向排列，从最负的(上)到正的(下)。（B）生酮饮食导致研究者人类队列中双歧杆菌物种丰度的持续减少。每条线连接每个研究对象的两个饮食组之间的成对样本，在研究对象的肠道菌群中检测到双歧杆菌。
2、生酮饮食在某种程度上以有别于高脂肪饮食方式改变了肠道菌群
高脂肪饮食(HFDs)以消耗拟杆菌为代价，重复地增加厚壁菌，但本研究发现KDs具有相反的效果。为了解释这一差异，研究者给予C57BL/6J小鼠3组饮食，为期3周(图3A)：低脂饮食(LFD，78/12/10；CHO/fat/protein)，HFD (15/75/10)，KD (0/90/10)。与其他饮食相比，KD提高了血浆中酮体β-羟丁酸(βHB)水平(图3B)。喂食HFD和KD的小鼠比喂食chow和LFD的小鼠消耗更多的卡路里(图3C)，体重增加更多(图3D)。16S-seq显示，饮食对肠道菌群有显著影响(图3E)。HFD增加了厚壁菌门丰度，减少了拟杆菌门丰度，然而，KD逆转了这一趋势（图3F）。比较HFD和KD，研究者发现10个差异丰富的属（图3G），双歧杆菌在KD中下降最多。两种饮食的总定植量是相当的(图3H)。在独立的小鼠设施中，经过10周的饮食干预（图S2A–S2C），动物体内的微生物变化稳定且可重现，并且长期喂养可长达11个月（图S2H和S2I）。相较于LFD组，HFD以及KD组热量摄取量，体重和肥胖显著更高。与HFD组相比，KD组小鼠体重增加明显减少(图S2E)，尽管性腺脂肪和肝脏重量没有显著差异(图S2F及S2G)。
研究者用富含植物多糖的碳水来源重复了这些发现(图S3A；表S4)。每只小鼠按降低食物CHO的顺序喂食这些食物3天，肠道菌群在chow-LFD和HFD-KD转换后的一天内改变（图S3B）。拟杆菌门在CHO的限制下减少，而厚壁菌门则相应增加(图S3C)。放线菌对CHO有非线性响应，在属水平上也可检测到(图S3D)。这些结果与一个为期3周的饮食干预相一致，该干预将小鼠分为不同的饮食(图S3E)和不添加抗性淀粉的实验(图3F)。饮食和肠道菌群之间的非线性关系表明，可能存在一个临界点，在这个临界点上，肠道菌群对大量营养素摄入的反应不同。
为了更准确地确定这个临界点，研究者测试了含有CHO水平的饮食(图4A)包括原始HFD (HFD75；15%CHO)和KD (0% CHO)，HFD85 (5/85/10)和HFD89 (1/89/10)。随着饮食中CHO的降低，体内循环酮水平增加(图4B)。在热量摄入、体重或肥胖程度上没有显著差异。在HFD75/HFD85和KD之间肠道菌群有显著变化，而在HFD89和KD之间没有变化(图4)。与HFD75相比，三种CHO减少的饮食拟杆菌均增加，放线菌逐渐减少(图4G)。研究者检测了HFD89和KD之间的两个差异丰度属(图4H)。双歧杆菌随着CHO的减少呈逐渐下降趋势(图4H)，反映放线菌门整体情况(图4G)。乳酸菌在KD上显著降低(图4H)，尽管厚壁菌门没有整体变化(图4G)。这些结果表明，尽管继续摄入CHO，但酮生成的部分诱导足以改变肠道菌群。
图3 生酮饮食对肠道菌群的影响不同于高脂肪饮食
（A）日常饮食和三种半纯饮食的低营养成分（以卡路里百分比计）：低脂饮食（LFD），高脂饮食（HFD）和生酮饮食（KD）。(B)喂养3周小鼠βHB循环水平(n = 6只小鼠/组，***p < 0.001；TuKEy’s test的单因素方差分析)。（C）饮食干预3周中每只小鼠每天平均总卡路里摄入量（kcal）（n = 6只小鼠/组，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001；ns，不显著；采用TuKEy检验的单向方差分析。(D)饮食干预3周后与基线相比体重变化百分比(n = 6只小鼠/组，*p < 0.05)。(E)菲尔-欧几里得距离的主坐标分析显示，饮食对群落组成有显著影响(p = 0.001, r2= 0.60；ADONIS)；与KD相比，HFD的群落组成也有显著差异(p = 0.005, r2= 0.45；ADONIS)。(F)各饮食中各主要菌门微生物群落的相对丰度(n = 4-6只小鼠/组，*p < 0.05， **p < 0.01)。（G）HFD和KD之间丰度显著不同的属(FDR <0.1,DESeq2)的Fold change在KD喂养的小鼠(n = 6只小鼠)中。（H）喂养不同饮食的小鼠粪便细菌DNA含量，以16S rRNA基因拷贝数/克湿重表示，无显著差异。
图4 饮食中碳水化合物的适度变化与部分诱导生酮作用有关，足以改变肠道菌组成
（A）四种半纯化饲料的宏量营养素组成(卡路里百分比)，其CHO含量从15% (HFD75)降至0% (KD)。每种饮食的CHO和脂肪含量都显示在柱状图的下面，所有饮食的蛋白质含量都匹配在10%千卡。(B)连续3周喂养各饮食的小鼠的循环βHB水平（n = 5只小鼠/组，* p <0.05，** p <0.01；单向方差分析，采用TuKEy检验）。(C)总体平均热量摄取量，即在饮食干预的3周内每只小鼠每天的千卡热量，在饮食组之间没有显著差异(n = 5只小鼠/组；ns,不重要；单向方差分析)。(D)饮食干预3周后各组小鼠体重差异无统计学意义(n = 5只/组；ns,不重要；单向的方差分析)。(E)在基线和饮食干预3周后，使用EchoMRI测量的体脂百分比的变化，在饮食组之间没有显著差异(n = 5只小鼠/组；ns,不重要；单向方差分析)。（F）PhILR欧式距离的主坐标分析显示，相比HFD75与KD（p = 0.013，r2 = 0.15）和HFD85与KD（p = 0.001，r2 = 0.13），而HFD89与KD相比（p = 0.066，r2），群落组成存在显著差异。每个数据点代表一个粪便样本，符号的颜色和形状分别代表饮食组和粪便收集日（n = 5只小鼠/组；通过ADONIS测试饮食效果并说明小鼠内重复）。（G）各饲料喂养3周小鼠微生物群落中各主要门的相对丰度。(H) HFD89与KD比较，各组间双歧杆菌和乳杆菌属的相对丰度差异显著(FDR <0.05,DESeq2) (n = 5只小鼠/组，*p <0.05，**p < 0.01)。
3、酮体直接抑制肠道菌生长
多种机制可能导致了HFD和KD之间肠道菌群不同。先前的研究表明，饮食缺乏多糖的小鼠觅食粘液增加。然而，本实验中，即使在没有饮食CHO的情况下，黏液层仍保持不变(图S4A-S4C)，而缺乏结肠粘蛋白的muc2缺陷小鼠KD饮食仍然表现出类似的肠道菌群变化(图S4D-S4F)。由于胆汁酸在脂肪乳化中的作用，研究者也考虑了胆汁酸。然而，在人类粪便样本中和小鼠盲肠内容物中，未观察到两种饮食之间总胆汁酸池有显著性差异(图S5A；图S5B；表S5)。后重点关注可指示脂质氧化增加以应对CHO限制的酮体。尽管肝脏是主要的生酮器官，但肠上皮细胞也能够产生酮体，KD期间肠组织的βHB升高。
为了研究在没有CHO限制的情况下酮体对肠道菌群的影响，研究者在HFD中添加了合成酮酯（KE）（图5A），模仿了βHB的睾丸生成。作为阳性对照，本实验也纳入了有或没有KEs的KD。在两个独立的实验中，在HFD中，KE的补充显著提高了βHB的循环水平，尽管在3周内低于KD的摄入量（图5B）。在HFD或KD中补充KE可显著增加肠腔内βHB浓度(图5C)。研究者还观察到肠组织βHB升高(图5D)。各组的热量摄入相似(图5E)；然而，喂食KEs的小鼠体重增加明显减少(图5F)。与HFD对照组相比，饲喂HFD-KE的小鼠肥胖程度也显著降低(图5G)。16S-seq显示，补充KE显著改变了HFD的肠道菌群(图5H)。在饮食和药理学上对酮症的诱导作用中，三个属持续发生变化（图5I）。三者中，只有双歧杆菌在肠腔内与βHB呈显著的负相关(图5J)，且在人类和小鼠的KD组中丰度也呈下降趋势(图1E和3G)。
βHB对人体肠道菌群也有类似的影响。研究者培养了4名人类粪便样本，这4名为喂食三种不同浓度的βHB(12.5、25和50 mM)的BD或空白对照。βHB以剂量依赖的方式抑制了这些离体群落的生长（图5K），并且16S-seq显示了在50 mM βHB时在菌门水平上微生物群落广泛变化（图5L），尽管没有明显增长（图5K）。研究者观察到，与对照相比，50 mM βHB组放线菌丰度明显降低，拟杆菌门数量明显增加。研究者还发现，在βHB存在的情况下，体外菌群中共有12个属发生了显著改变，其中包括双歧杆菌和乳酸菌丰度下降(图5M)。
图5 酮体直接抑制肠道细菌生长
（A）包含βHB的酮酯（KE）的化学结构，βHB与两个代谢为βHB的6碳中链脂肪酸连接。（B）分别喂养3周的HFD，KE补充的HFD（HFD-KE），KD或KE补充的KD（KD-KE）的小鼠中的循环βHB水平(C)各饲料喂养3周小鼠盲肠βHB浓度(两次独立实验11-12只/组，**p < 0.01)。(D)喂食不同饲料3周小鼠结肠组织中βHB的浓度。(E)总体平均热量摄取量，以三周饮食干预后每只小鼠每天的千卡为单位，各组间无显著差异。（F）与HFD或KD相比，饮食干预3周后，饮食中添加KE的小鼠（HFD-KE和KD-KE）相对于基线的体重变化百分比明显更低。(G)在基线和3周后使用EchoMRI测量的体脂百分比变化，与其他饮食相比，饲喂HFD-KE的小鼠的体脂百分比变化显著降低。（H）PhILR欧几里得距离的主坐标分析显示，饮食组之间的微生物群落明显不同，并且HFD饮食上的微生物群落与其他饮食组明显不同。（I）相较于小鼠微生物群落中的基线，在HFD与KD和HFD与HFD-KE之间进行比较时，属变化倍数始终不变。(J)饲喂HFD或HFD-KE，3周小鼠盲肠βHB水平与双歧杆菌折叠变化呈负相关。（K）在厌氧条件下，在24小时内，用不同浓度的βHB（12.5、25和50 mM）或媒介物对照（0 mM）测量来自四名健康供体的粪便悬浮液的生长。显示四个供体之间的平均生长曲线，每个供体每个浓度一式四份，用阴影区域表示标准误差（使用R中的stat_smooth函数）和在24小时内以15分钟间隔测量的光密度（600 nm）（L）在四个离体群落中与50 mM βHB或媒介物对照（0 mM）孵育16 h的居中对数比率（CLR）归一化主要门的丰度。每条线连接并与βHB或媒介物对照一起孵育同一供体的微生物群落。(M)与对照相比，50 mM βHB对丰度显著改变的属(FDR <0.05, DESeq2)在16小时的Fold change。
βHB直接限制体外双歧杆菌生长，研究者从人类粪便样本中分离出了Bifidobacteriumadolescentis（BD1菌株）（这是人类队列中差异最大的双歧杆菌物种）（图2A）。βHB对BD1体外生长的抑制作用呈剂量依赖性(图S6A)，在最高浓度下具有抑菌作用(图S6B)。丁酸盐是一种短链脂肪酸，其化学性质与βHB相似，具有类似的生长抑制作用(图S6C)。在添加到培养基之前，βHB和丁酸盐的中和作用消除了它们的生长抑制作用(图S6A和S6C)。生长培养基的酸化使其与已知βHB浓度的培养基的pH值相匹配，从而重新说明了对BD1菌株生长的抑制作用（图S6D），表明βHB通过pH依赖性机制抑制了BD1菌株的体外生长。
为了评估βHB的特异性，研究者针对来自6种不同门的35种肠道细菌分离株（图S6E和S6F）对其进行了测试，其中包括从研究者的人类队列中分离出的4种双歧杆菌菌株：2株青春双歧杆菌菌株（BD1和BD2菌株），长双歧杆菌（BD3株）和Angulatum双歧杆菌（BD4株）。对于大多数分离株，阻止90％生长所需的浓度（MIC90）在25–50 mM之间，但在最高测试浓度下，埃吉氏菌和乳杆菌属分离株对βHB抑制不敏感。研究者还检测了βHB对所选细菌的促生长作用(图S6E)。与研究者的体内(图5I)和体外(图5M)研究相反，研究者没有检测到βHB对双歧杆菌的选择性作用。与观察到的在人类（图1D），小鼠（图3F和4G）和离体孵育（图5L）中消耗KD期间，拟杆菌属相对丰度增加相比，拟杆菌属相对于另一种门倾向于对βHB的生长抑制更为敏感（图S6F）。因此，体内观察到的βHB对双歧杆菌的靶标特异性可能受种间相互作用和/或环境因素驱动。
与后一种假设一致，细菌单培养中用于达到MIC90的βHB浓度与人体内循环βHB浓度大致相同数量级–生酮饮食的恒定血清βHB浓度可达到2 mM以上-但超出肠道内腔的估计生理范围。研究者的数据表明喂养生酮饮食盲肠内容物中的βHB浓度大约为5 nmol/g（图5C），比研究者体外实验中测试的浓度（12.5–50 mM）低多个数量级。需要在复杂的微生物群落和胃肠道生理背景下进一步阐明βHB对双歧杆菌的作用机制。
4、对宿主病理生理的下游影响
在单定植小鼠体内人肠道双歧杆菌(包括B. adolescentis)诱导促炎肠道Th17细胞。KD的摄入抑制了单定植小鼠肠道Th17细胞的诱导(图6B)，与饲喂HFD小鼠相比，回肠中B. adolescentis定植明显减少(图6C)。2种饮食中B. adolescentis单定植肠道中的CD4+干扰素(IFN)γ+(Th1)细胞水平(图6D和6E)没有受影响，与之前B. adolescentis优先诱导小肠Th17细胞的报道一致。这些数据表明，KD在一定程度上是由于宿主酮体的产生（图6F），其通过降低B. adolescentis定殖水平来介导这些小鼠肠道Th17诱导的缺乏。
接下来研究人类完整肠道菌群双歧杆菌相对丰度变化是否转化为肠道Th17细胞积累的差异。研究者用在BD或KD阶段收集的人类供体的粪便微生物群和补充了BD1（KD+BA）的双歧杆菌耗尽的KD微生物群接种在无菌小鼠上。补充概括了BD微生物群中双歧杆菌在门（图6G）和属（图6H）水平的丰度。粪便样本的16S-seq显示，BD和KD菌群之间均建立了不同的微生物群落(图6I)。KD组的双歧杆菌丰度明显低于BD组和KD+BA组(图6J)。与移植后第12天检测到的BD组和KD+BA组相比，接受KD菌群的小鼠肠道Th17频率明显降低(图6K)。Th1细胞群无显著差异(图6L)。这些结果表明，复杂的人类肠道菌群落中双歧杆菌的丰度变化可能对肠道Th17积累产生重大影响。
鉴于人粪移植BD与KD相关菌群足以揭示肠道中Th17细胞的差异积累，研究者假设在传统小鼠饮食实验中也可以检测到肠道中Th17频率的差异。与此假设相符，与喂食HFD的小鼠相比，喂食KD的常规小鼠小肠（SI）的Th17细胞水平较低（图7A和7D）。同样，小鼠喂食添加了KE的HFD，相对于HFD，降低了肠道菌群中双歧杆菌的丰度(图5I)，导致Th17细胞在小肠中的蓄积量降低(图7A)。大肠内(图7B)或脾脏(图7C)Th17细胞水平无显著差异。小肠和脾脏中其他免疫细胞群的免疫表型分析（图S7B）未显示出将HFD-KE和KD与HFD相一致的变化。
饮食中CHO摄取量的微小变化也可以观察到小肠Th17细胞积累的差异(图7D)。与类似的高脂肪，低CHO饮食相比，用KD喂养的小鼠的肠道Th17频率显著降低（图4A），这与KD上双歧杆菌丰度的显著降低相一致（图4H）。肠道Th17细胞水平与双歧杆菌丰度不直接成正比，研究者观察到仅在KD组肠道Th17细胞频率显著下降（图7D），尽管随着饮食中CHO的减少双歧杆菌丰度逐渐下降（图4H）。此外，相对于HFD85（5％CHO），HFD89（1％CHO）导致Th17细胞显著增加。这些结果表明，肠道中双歧杆菌可能需要一定的丰度阈值才能诱导固有层中的Th17细胞反应，或者其他宿主或微生物因素可能有助于观察到的Th17差异。其他免疫细胞亚群（包括Th1细胞（图7E）和Treg细胞（图7F））没有显著变化。
鉴于肠道和其他组织隔室之间发生免疫串扰的证据不断增加，研究者接下来思考是否可以更系统地检测肠道中观察的Th17反应差异。尽管研究者没有观察到脾脏中Th17频率的任何差异，但与其他具有类似Th1（图7H）细胞群体模式的饮食（图7G）相比，研究者发现HFD89和KD组内脏脂肪组织中Th17细胞积累显著下降，Treg细胞群体无差异（图7I）。这些结果补充了最近的发现，这些发现突出了生酮饮食对内脏脂肪组织中免疫细胞的影响，并提出了一个有趣的问题，即观察到的脂肪Th17细胞的变化是否与肠道菌群诱导的脂肪代谢变化有关。肠道免疫环境或循环βHB可能直接调节脂肪组织中的免疫细胞功能。研究者的发现强调了极低CHO饮食(0%-1%)与低CHO饮食(5%-15%)在肠道菌和免疫反应方面的区别。
图6 KD相关的微生物群减少无菌小鼠肠道Th17细胞的积累
（A）双歧杆菌BD1（BA）在喂食HFD的小鼠的小肠（SI）而非大肠（结肠）中诱导了一个健壮的Th17种群。Th17群体的测量值为IL-17a+CD4+活细胞百分比。黑色和灰色条分别代表无菌(GF)和BA-单殖民化小鼠。左侧为代表性的IL-17a+CD4+活细胞群的流式细胞仪图。(B)喂食KD的BA-单克隆小鼠与喂食KD的无菌对照组相比，SI和结肠中均未显示肠道Th17细胞诱导。左侧为代表性的IL-17a+CD4+活细胞群的流式细胞仪图。(C)与HFD相比，饲喂KD的小鼠细菌DNA含量显著降低，表示为BA单克隆小鼠回肠内容物中16s rRNA基因拷贝数/克湿重。（D和E）分别喂食（D）HFD和（E）KD的无菌小鼠（GF，黑色条）和BA单独克隆（BA，灰色条）的小鼠在SI和结肠中的Th1种群没有显著差异。Th1种群以IFNg+ CD4+活细胞百分比衡量（n = 3-4只小鼠/组；ns，无显著性）。(F)与HFD相比，饲喂KD的GF和BA-单克隆小鼠循环中βHB水平显著升高。黑色和灰色条分别表示HFD和KD。（G和H）分别在基线饮食（BD）和生酮饮食（KD）阶段从相同的四个个体中收集的用于无菌移植的供体粪便样品的（G）门和（H）属水平的群落组成，第三样品，包括补充了双歧杆菌BD1（KD + BA）的KD供体样品。（J）在整个实验过程中对三个移植组的小鼠粪便菌群中的双歧杆菌进行了丰度分析（n = 5-6只小鼠/组）。移植组之间的BA丰度显著不同。（K）接受KD菌群的小鼠的小肠Th17细胞水平明显低于BD或KD+BA移植组。移植后第12天收获组织。左侧显示了IL-17a+CD4+活细胞群体的代表性流式细胞仪图。（L）移植组之间小肠Th1细胞的数量没有显著差异。左侧显示了IFNg+CD4+活细胞群体的代表性流式细胞仪图。
图7 生酮饮食和酮酯喂养降低了常规小鼠肠道Th17细胞的积累
(A)与HFD喂养3周的小鼠相比，添加KD或酮酯(KE)的SPF小鼠小肠Th17细胞的出现频率明显降低。左侧为代表性的IL-17a+CD4+活细胞群的流式细胞仪图。(B和C)分别喂养3周的小鼠(B)结肠和(C)脾脏中Th17细胞水平无显著差异。(D)与喂食类似的高脂肪、低cho饲料的小鼠(见图4A)相比，喂养KD的SPF级小鼠小肠Th17细胞的频率明显降低(见图4A)。(E、F)饮食干预3周后，各组小肠(E) IFNg+ CD4+ Th1、(F) Foxp3+ CD4+ Treg细胞数量差异无统计学意义。（G）在小鼠的附睾白色脂肪组织中的Th17细胞群喂食了各自的饮食3周。附睾脂肪中IL-17a+ CD4+活细胞群体的代表性流式细胞仪图显示在左侧。(H)小鼠附睾白色脂肪组织中IFNg+CD4+ (Th1)细胞群分别喂食饲料3周。(I)饮食干预3周后，附睾白色脂肪组织中Foxp3+CD4+ (Treg)细胞数量组间差异无统计学意义
讨论
综上所述，这些结果表明，饮食引起的宿主代谢物的变化改变了肠道菌群，并对免疫细胞产生了下游的影响。KD对肠道菌群的影响不同于HFDs，部分原因是伴随宿主产生酮体。考虑到肥胖与慢性轻度炎症之间的联系，KD饮食中肠组织和脂肪组织中促炎Th17细胞水平降低可能是KD更好地改善代谢综合征的某些方面例如血糖控制和减少体内脂肪的原因。
除了在临床试验中报道的代谢作用外，自1920年代以来，KD一直被用作顽固性癫痫的饮食疗法，最近的研究发现，在抗癫痫药物无效的儿童和成人中，KD可显著改善他们的症状。然而，KDs治疗癫痫的作用机制尚不清楚。近期一篇论文提供了肠道菌群在介导难治性癫痫小鼠模型中KD抗癫痫作用的有趣证据。有趣的是，另一篇论文显示，与对照组相比，难治性癫痫患者循环中的Th17细胞比例增加，而服用KD后部分被逆转。强调了Th17免疫应答在癫痫发病机制中的潜在作用，并与研究者的数据一致，表明食用KD的肠道和脂肪组织中Th17细胞频率降低。这些观察结果为未来研究Th17免疫反应作为KD治疗难治性癫痫和可能与Th17活化增加相关的其他疾病（例如自身免疫性疾病）疗效的潜在机制提供了前提。未来需要进行更多的研究，以更好地了解KDs在人类健康和疾病方面的长期影响。
此研究强调了肠道菌群在介导肠道Th17细胞应对KD消耗反应变化中的作用。研究者专注于双歧杆菌，其在人类和小鼠KD消耗过程中以及在给小鼠饲喂合成的KE后，其丰度都可重复地降低。饮食和肠道菌群对Th17细胞的影响可能是有益的，也可能是有害的，这取决于在炎症性疾病，肠道病原体防御和癌症免疫疗法等方面对这些复杂相互作用的比较分析。还需要进一步研究KD摄入后肠道菌群其他成员潜在的变化结果。KD和KE补充后，小鼠体内的乳酸菌都降低了。在人类中，Fusobacteria和Escherichia均在KD上显著富集，这都与大肠癌的易感性有关。这些结果表明，KD对宿主健康和疾病的短期和长期影响可能取决于一系列复杂的微生物生态学的有益，中性和有害变化。
βHB具有抑制NLRP3炎症小体的能力，因此具有抗炎作用。KD期间βHB的产生除改变微生物介导的免疫调节外，还可以直接影响免疫反应。然而，研究者的当前研究提供了证据，证明肠道菌群在介导食用KD时观察到的免疫反应中起了因果作用，从饲喂KD的人类供体与基准饮食的粪群移植结果比较足以揭示肠道Th17细胞积累中的差异。研究者的数据支持了特定肠道细菌特别是双歧杆菌变化在调节肠道Th17细胞群方面的贡献，这与之前的结果一致，即双歧杆菌能够有力地诱导肠道Th17细胞。
给HFD口服补充酮酯表明KD诱导的微生物群转移部分是通过宿主产生酮体来介导的。在KD的情况下，CHO限制和βHB均可导致双歧杆菌的显著减少，并且不相互排斥。研究者尝试通过精细的饮食梯度实验和补充KE来剖析CHO与βHB的相对重要性。双歧杆菌丰度的下降与诱导生酮作用有关，而不是与CHO的完全缺乏有关，这为酮体的重要性提供了额外的支持。但是，研究者还观察到低脂，高植物多糖食物的小鼠双歧杆菌水平低，值得进一步研究。
还需要进一步的研究来分析相对于肠，肝生酮对肠道菌变化的相对贡献。肠道上皮中酮体的局部产生可能与肠道菌群更相关，而在KD期间肝脏产生的循环βHB升高也可能直接或间接影响肠道菌群。比较肠道相对于肝脏生酮对肠道菌的相对影响，可能会提供一些酮体产生在肠道上皮中生理作用的见解。
结论
这项工作扩展了研究者实验室和其他机构先前的重要发现，证明了饮食对肠道菌群的影响不仅可以从动物模型转化为人类，而且在介导宿主对饮食免疫反应中似乎起着重要作用，阐明了这些机制基础的进展可能有助于提供更多个性化的方法，以利用饮食干预措施来预防和治疗人类疾病。