科研 | 李兰娟：合理开发具有多种功能的人类抗体混合物以保护泛SARS冠状病毒
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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保护性单克隆抗体混合物的组成和协同机制的结构原理尚不清楚。在本文中，我们利用抗体协同性开发了一种治疗性抗SARS-CoV-2的混合物抗体。在我们之前鉴定的人源交叉中和抗体H014的基础上，我们系统地分析了一个全人源抗体库，合理地鉴定出了一个强有力的中和抗体搭档P17，在动物模型中具有有效的保护作用。冷冻电镜研究解剖了P17抗原表位的性质，P17抗原表位是SARS-CoV-2特异性的，与H014抗原表位明显不同。SARS-CoV-2与H014和P17复合物的高分辨率结构以及功能研究表明，在双抗体混合物中，通过S1屏蔽和构象锁定可以实现协同中和，从而阻断受体附着和病毒膜融合，这具有高效力以及对病毒突变逃逸的不确定性。此外，聚类分析确定了一个假设的第三抗体成员，进一步加强了混合物作为泛SARS冠状病毒的治疗。
论文ID
实验设计
实验结果
1. H014候选搭档NAb P17的鉴定和表征
通过噬菌体展示技术，我们先前鉴定了一种人源化治疗性抗体H014，能够通过识别RBD中的一个保守斑块而交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV。在动物模型中，我们使用H014单药治疗可有效预防SARS-CoV-2感染。为了为理想的混合物选择H014的伴侣，我们寻找了：(1)针对SARS-CoV-2的特异性抗体；(2)高度有效的；(3)与H014和RBD靶向不竞争；(4)起源于人类。在筛选研究中，我们以SARS-CoV-2重组RBD为靶点，针对全人源抗体库(ST-ST-HuNAL, Fabformat, SanyouBio)，使用标准的固相免疫管筛选方法，产生了大量的多种抗体。经过3轮摇选，我们筛选出80多个独特序列对靶标具有较强亲和力的克隆作为铅击，将其构建成全长IgG1并通过ExpiCHO系统表达。在这些先导物中，P17抗体与SARS-CoV-2 RBD紧密结合，酶联免疫吸附试验(ELISA)显示其有效浓度(EC50)为29 pM的一半(图S1)。为了研究P17的病毒特异性，我们表达并纯化了重组SARS-CoV RBD进行结合研究。表面等离子体共振(SPR)检测结果表明，P17与SARS-CoV-2 RBD的结合高度为96 pM，但P17与SARS-CoV RBD没有相互作用，表明P17具有SARS-CoV-2特异性(图1a)。为了深入了解P17识别的表位，我们使用竞争性SPR表位结合试验，将SARS-CoV-2 S三聚体上的抗原位点定位到H014，H014结合RBD一侧的保守表位，不同于受体结合基序(RBM)。标记为SARS-CoV-2 S三聚体的CM5传感器先用H014饱和，再用P17淹没，或者先用P17饱和，再用H014流过传感器。虽然S三聚体已被第一抗体饱和(~600 RU为结合信号)，但第二抗体仍能与S三聚体结合，结合信号高达1200 RU，这表明尽管这两种抗体没有变构结合模式(图S2)，P17识别的表位不同于与H014结合的表位(图1b)。我们进一步检测了P17对SARS-CoV-2的体外中和能力，免疫荧光染色结果表明，P17对SARS-CoV-2感染的预防作用呈剂量依赖性(图S3)，而Huh7细胞的伪病毒中和试验(PSV)和Vero细胞的标准50%斑块减少中和试验(PRNT)均显示P17在IC50和PRNT50值分别为165和195 pM时表现出更强的中和活性(图1c, d)。值得注意的是，P17对SARS-CoV-2的中和活性是H014的200倍，P17和H014的混合物即使在病毒滴度更高的情况下也表现出适度的协同中和活性(图1e)。虽然P17在伪分型中和试验中对SARS-CoV没有抑制活性，但由于H014的交叉中和活性，P17和H014混合物在亚纳米水平上对SARS-CoV伪病毒表现出强大的中和活性，表明这种混合物可能具有泛SARS-CoV保护作用(图1f)。
图1 H014候选搭档NAb P17的鉴定和表征
(a) P17与SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD结合的亲和力分析。(b) P17和H014竞争结合SARS-CoV-2的SPR动力学。P17在Huh7细胞中的伪病毒中和试验(c)和P17在Vero细胞中的PRNT中和SARS-CoV-2活性(d)。P17、H014的中和活性，以及抗SARS-CoV-2活病毒(e)和SARS-CoV假病毒(f)的不同浓度混合抗体的中和活性。
2. P17对SARS-CoV-2敏感小鼠的预防和治疗作用
考虑到P17在pM浓度下出色的中和活性，我们接下来试图评估P17在新建立的hACE2小鼠模型中的体内保护作用。鼻内接种SARS-CoV-2(5×104PFU)可使病毒在hACE2小鼠的气管和肺部大量复制，接种5天后我们观察到轻度肺病理。我们在hACE2小鼠接种SARS-CoV-2前12小时或接种后4小时分别给予P17，分别为预防(P)或治疗(T)(图2a)，在治疗模式中，小鼠按每公斤体重20 mg一次性腹腔注射P17可显著减少SARS-CoV-2病毒，与对照组相比，其肺和气管中的RNA负载(图2b, c)；而在预防模式下，给予两剂P17的效果更显著，导致肺部和气管的病毒载量分别减少193倍和412倍(图2b, c)。与H014相比，更低剂量(20 mg/kg vs 50mg/kg)的P17在减少病毒RNA方面产生了类似的保护作用；同样，RNAscope进行的原位杂交(ISH)试验在对照组小鼠中检测到大量SARS-CoV-2特异性RNA，而在P17给药小鼠中检测到的病毒RNA信号很少(图2d)。免疫荧光染色显示，P17给药后，只检测到少量SARS-CoV-2蛋白阳性细胞，而PBS处理的小鼠沿气道肺泡内病毒蛋白表达丰富(图2e)。值得注意的是，P17治疗组的所有小鼠在5 dpi时肺/气管中不再有传染性病毒，这是通过肺组织匀浆的空斑试验测定的(图2f)；更重要的是，组织病理学检查发现，PBS对照组hACE2人源化小鼠在第5天出现间质性肺炎，表现为炎性细胞浸润、肺泡间隔增厚和特异性血管系统损伤(图2g)。相比之下，P17治疗组小鼠肺只出现非常轻微的炎症细胞浸润，肺泡上皮细胞未见明显病变或局灶性出血(图2g)。这些结果表明，P17是一种有效的中和抗体，可以有效保护小鼠免受SARS-CoV-2的侵袭，此外，在建立的SARS-CoV-2小鼠适应毒株MASCp6小鼠模型中，P17和H014的混合物的保护效果提高了2-10倍(图2h, i)。
图2 P17的预防和治疗效果
(a) P17在两个SARS-CoV-2易感小鼠模型中的治疗示意图。(b)肺中的病毒RNA载量为5 dpi，以每克RNA副本的形式表达。(c) 病毒在气管中的RNA载量为5 dpi，以RNA拷贝数/克表示。(d) 用SARS-CoV-2特异性探针检测SARS-CoV-2基因组RNA。(e)SARS-CoV-2特异性抗体免疫小鼠肺染色。(f) hACE2小鼠肺中病毒载量为5 dpi时，用空斑法测定。(g) 5 dpi时小鼠肺组织病理学特征。
3. SARS-CoV-2三聚体S与P17复合物的结构
为了准确定义P17抗原表位，我们利用单粒子低温电镜对P17 Fab片段与SARS CoV-2 S外结构域三聚体之间的复合物进行了表征。对复合物的低温电子显微镜表征显示抗体的充分占用，其中一个Fab与同型三聚体S的每个RBD结合(图3a)。与之前的研究类似，3D分类显示复合物采用两种截然不同的构象状态，分别对应一个RBD open +两个RBD closed(状态1)和两个RBD open +一个RBD closed(状态2) (图3a)。我们在3.6和3.8 A分辨率下分别得到了状态1和状态2的SARS-CoV-2-P17复合物的不对称重构(图S4-S7)。RBD-P17区域的构象迁移率代表了构象的动态连续体，限制了绑定接口的映射质量(图S5)。为了提高绑定接口的分辨率，我们采用优化的“基于块的”重构方法进行局部细化，这导致局部分辨率提高到3.9 A，使交互模式的可靠分析(图S5-S7和表S1)。
P17识别受体结合基序(RBM)上的构象表位，仅涉及蛋白-蛋白接触，这与H014存在时竞争性结合分析的结果一致(图1b)。从理论上讲，SARS-CoV-2 S三聚体的糖基化可能不会影响P17与P17和H014混合物的结合和保护作用，与H014的表位只有在RBD“开放”时才能被访问不同，P17的表位在开放和封闭的RBD状态下都可以访问，这与Fab与S三聚体的化学计量结合是一致的(图3a，图S8)。正如预期的那样，在复杂结构中我们可以观察到由于“闭合”和“打开”状态切换而产生的随机RBD不同角度的旋转(图3b，图S8)。P17通过靶向RBM与各种状态的RBD紧密结合，表明在与宿主细胞的整个动态交互过程中，P17受到了强烈的干扰，P17的足迹占S单个单体的~900 A2的面积，轻链和重链的变量域分别占相互作用界面的~30%和70% (图3c-e)。
4. P17抗原表位
接下来，我们对P17 Fab与S结合的复合物的结构进行分析以确定抗体的表位。有趣的是，有趣的是，除了靶向RBM外，与“闭合”RBD结合的P17通过第四个暴露于溶剂的环，即DE环（也称为L4环，与CDRL1和CDRL2相邻，CDRL1和CDRL2连接在抗体上的D和E链）与相邻RBD（残基374–376构成β2的上游环）从轻链接触(图3f-h，图S9)。这些S上的接触残基可能代表P17的“非必需”或“动态”表位。考虑到特定的交互模式涉及到两个相邻RBD的形成联系，P17的能力在某种程度上连接两个相邻单体，这可能限制的发展所需的构象变化病毒的生命周期从十二postfusion阶段(图3 a、g)。
P17主要通过5个CDR环与RBD相互作用：CDRL1(残基29-33)、CDRL3(残基90-96)、CDRH1(残基30-33)、CDRH2(残基50-59)和CDRH3(残基99-106)(图3c, h)，必需的P17表位包含14个位于RBM上的残基。其中有11个残基(78.6%)在SARS-CoV和SARS-CoV-2之间不保守，解释了其病毒特异性结合和中和活性(图S10)。SARS-CoV的m396、80R和F26G19等抗原表位以及P17的抗原表位表明，SARS-CoV-2的RBM核心(465-495残基；SARS-CoV中的455-485残留物)主要更可能是病毒特异性的。L455、F456、V483、F486、C488、Y489、F490在轻链的RBM、Y32、Y92和重链的Y32、H35、Y59、H99、M103上形成疏水相互作用网络，使其紧密结合成为可能(图3d, f，表S2)；此外，广泛的亲水性相互作用进一步加强了RBD-P17的相互作用(图3d, f，表S2)。最近，在目前流行的菌株中报道了一些RBD的点突变，P17与这些RBD突变体(N354D/D364Y,V367F, R408I和W436R)具有相当的结合亲和力，表明P17对大多数流行菌株具有广泛的中和潜力(图S10-S11)。
图3 SARS-CoV-2 S三聚体与P17复合物的低温电镜结构
(a) 具有一个开放和两个封闭RBDs的状态1结构(左)和具有两个开放和一个封闭RBDs的状态2结构(右)的正交视图。(b) 由于“闭合”和“打开”状态之间的切换，随机的RBD旋转具有不同的角度。(c) SARS-CoV-2 RBD(粉红色)与P17 Fab复合体结构的卡通表现。(d) P17 Fab与SARS-CoV-2 RBD的结合袋。(e) SARS-CoV-2 RBD的P17表位。(f) P17 Fab与SARS-CoV-2 RBD的相互作用。(g) 与“闭合的”RBD结合的P17也与相邻的S接触RBD。(h) P17和SARS-CoV-2 RBD之间接口的详细信息。
5. P17与H014的协同中和机制
此前，我们已经证明，H014中和SARS CoV-2是通过空间位碰撞阻止病毒附着在ACE2受体上，尽管没有针对RBM；而P17与RBM紧密结合，因此能够通过使结合位点不可用来完全阻断SARS CoV-2与ACE2的结合。竞争抑制实验结果表明，P17能够有效消除SARS-CoV-2 RBD和ACE2之间的相互作用(图S12)。结构分析显示，对应ACE2不可达状态的“封闭”RBD构象仍然能够与P17结合，表明SARS-CoV-2 S三聚体完全闭塞。为了功能性地验证这一点，我们进行了两组SPR试验，首先将三聚体S暴露于P17，然后暴露于ACE2，或者反过来。可以预期的是，P17的结合完全阻断了ACE2与SARS-CoV-2三聚体S的结合，并且由于P17与ACE2相比对SARS-CoV-2三聚体S的结合亲和力更强，已经结合到三聚体S的ACE2可以被剥离并被P17所取代（图4a）。为了在基于细胞的病毒感染模型中进一步验证这些结果，我们在Vero细胞中进行了吸附前和吸附后抑制试验。正如预期的那样，P17与SARS-CoV-2的孵育以剂量依赖性的方式阻止病毒附着到Vero细胞表面，并且已经吸附到细胞表面的病毒颗粒可以在高浓度下被P17完全剥离（图4b）。SARS-CoV-2 RBD -ACE2复合体的结构与SARS-CoV-2 RBD -ACE2复合体的结构重叠，表明ACE2与其相邻的两个P17发生严重冲突，暗示P17会阻碍SARS-CoV-2 RBD与其ACE2受体的结合(图4c)。由于P17的特异性结合模式，可能存在额外的中和模式，为了探讨P17是否能在融合阶段抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞，我们以表达SARS-CoV-2 S的293T细胞为效应细胞，以Vero-E6细胞为靶细胞，建立了S介导的细胞-细胞融合系统。在效应细胞和靶细胞共培养48小时后，表达SARS-CoV-2 S蛋白的细胞融合成一个大的多核合胞体，而用不同浓度的P17预处理效应细胞，在很大程度上阻断了合胞体的形成，表明P17能够阻断病毒膜融合（图4d）。为了进一步阐明P17在融合阶段的能力，我们建立了体外膜融合实验，用胰蛋白酶和ACE2处理纯化的SARS-CoV-2病毒粒子可以在酸性环境下触发病毒与脂质体的膜融合。与细胞-细胞融合实验一致，P17可以有效地抑制ph依赖的SARS-CoV-2与脂质体的融合，并以剂量依赖的方式，但H014即使在高浓度下也不能这样做。有趣的是，P17在低浓度H014存在时表现出增强的抑制能力，这与它们的协同中和活性一致(图4e和1e)。
图4 P17与H014的协同中和机制
(a) P17和ACE2竞争结合SARS-CoV-2的SPR动力学。(b) 吸附前和吸附后抑制试验。(c) P17 Fab和ACE2在与SARS-CoV-2结合时发生冲突。(d) P17抑制S蛋白介导的细胞-细胞融合。(e) 不同浓度的P17阻断ACE2介导的SARS-CoV-2与脂质体的融合。
6. 抗体组合中的协同性是通过S1屏蔽和锁定构象来实现的
H014与P17合用对SARS-CoV-2具有协同作用。为了揭示双抗体组合协同效应的分子基础，我们对SARS-CoV-2 S三聚体与H014和P17 Fabs复合物进行了低温电镜分析，三元配合物的低温电镜结构整体分辨率可达3.2 A(图5a及图S6)。与大多数对载脂蛋白SARS-CoV-2 S三聚体或其复合物的结构研究不同，在观察到与0–3个RBD开放相对应的各种构象状态时，只有一个构象状态与所有3 RBD开放是我们在复杂的结构中观察到NAbs混合物的S（图5a）。这一观察结果也与SARS-CoV-2 S单独与H014或P17复合物所获得的结构见解大不相同（图3），总共有3份Nab混合物（3个H014和3个P17）绑定到一个S三聚体上。3个P17 Fab结合在每个RBD的顶部，与ACE2重叠并覆盖SARS-CoV-2 RBD的接触区域，形成“帽”层（shield-1），3个H014Fab结合在每个RBD的侧面，填充RBD和相邻NTD之间的空间，在盖层下方建造一个交错排列的外层（shield-2）（图5a）。这两层蛋白起到了盾牌的作用，屏蔽了S1的大部分区域，阻止了SARS-CoV-2 RBD与宿主细胞受体和细胞表面蛋白酶相互作用的可能性(图5a)，此外，6个Fab的协同作用可以阻止RBD的关闭，抑制S1进一步的构象变化，而这些变化是启动病毒融合过程所必需的。这些结构上的发现解释了混合抗体中和SARS-CoV-2机制的分子基础，并为H014和P17在中和SARS-CoV-2时观察到的协同作用提供了合理性依据。混合物中的两个NAbs可以同时结合RBD的不同区域；一种识别出SARS冠状病毒和SARS-CoV-2之间更保守的斑块，而另一种针对SARS-CoV-2特异性斑块(图5b)，表明这种混合物可能对泛SARS冠状病毒株提供有效和广泛的保护，此外，由具有非竞争活性的抗体制成的混合物，如在这种混合物中，至少有一种抗体识别高度保守的表位，理论上可以提供额外的保护，以防止任何可能发生的病毒逃逸中和。
图5 P17和H014抗体混合物协同作用的结构基础
(a) SARS-CoV-2 S三聚体与P17和H014复合物的整体结构。(b) P17和H014结合RBD的不同区域。(c-e) 基于P17和H014抗体混合物的多种潜在候选混合物。
结论
在此，我们应用合理的NAb筛选策略，结合基于SPR的交叉竞争分析和冷冻电镜分析，开发出新一代人NAb混合物，可产生广泛而有效的抗泛SARS冠状病毒的保护作用。本研究中描述的抗体混合物靶向SARS-CoV-2和SARS-CoV的峰值，识别两个不同中和簇的RBD，并通过阻断与宿主细胞受体的连接以及干扰病毒膜融合来中和病毒感染，从而赋予效力以及额外的保护，防止病毒中和逃逸。此外，我们对RBD上存在的各种中和簇的结构分析以及对其他假定抗体伙伴的识别，对开发治疗COVID-19的最优化抗体治疗组合具有指导意义，本篇文章揭示的naba -抗原相互作用的原理也可以促进设计治疗性混合物对抗其他病毒。