科研 | Nat Commun：用多功能铱（III）光敏剂分析线粒体氧化诱导细胞死亡的机制

编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

线粒体氧化诱导的细胞死亡是一种由多种癌症治疗药物引起的肿瘤氧化应激的生理过程，由于在产生线粒体特异性氧化应激和同时监测线粒体反应方面的困难，一直是研究的难点。因此，据我们所知，通过氧化应激的线粒体蛋白质氧化与随后的细胞死亡相关生物现象之间的关系尚未确定。我们开发了一种多功能铱(III)光敏剂Ir-OA，能够诱导大量线粒体氧化应激并监测相应的黏度、极性和形态变化。Ir-OA的光激活触发线粒体蛋白质交联和氧化的化学修饰(即氧化磷酸化复合物和通道及转位蛋白)，导致微环境改变，例如微黏度增加和去极化。这些变化通过过度分裂和融合诱导线粒体肿胀而与细胞死亡密切相关。基于蛋白质组学分析和现象学观察，我们提出了线粒体氧化应激导致细胞死亡的可能机制。

论文ID

原名：Analysing the mechanism of mitochondrial oxidation-induced cell death using a multifunctional iridium(III) photosensitiser

译名：用多功能铱（III）光敏剂分析线粒体氧化诱导细胞死亡的机制

期刊：Nature Communications

IF：12.121

发表时间：2021.01

通讯作者：Jeong Kon Seo和Tae-Hyuk Kwon

通讯作者单位：韩国蔚山科学技术院

实验设计

1. 采用9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)和二氢化荷丹明123(DHR123) 探究Ir-OA和Ir-OC是否具有产生ROS的能力；

2. 采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)、MitoTracker-Deep-Red（IMM荧光探针）和IMS染色测定Ir-OA和Ir-OC的亚细胞定位；

3. 采用CCK-8、MTT法、碘化丙啶(PI))和钙黄绿素(AM)探究Ir-OA是否通过线粒体氧化导致细胞死亡；

4. 使用时间相关单光子计数法(TCSPC)、磷光寿命成像显微镜(PLIM)探究Ir-OA是否会引起氧化应激触发微环境的变化；

5. 采用蛋白质组学探究Ir-OA引起线粒体氧化应激导致细胞死亡的潜在机制。

实验结果

1. 铱(III)配合物的表征

我们合成了带有(Ir-OA)和没有(Ir-OC)能量供体的铱(III)配合物(图1a、b和补充图19)。研究表明，2-苯基喹啉(2pq)配体的阳离子铱(III)配合物由于具有向分子氧传递能量和电子的HOMO和LUMO能级的作用，有效地生成了单态氧(¹O₂)和超氧自由基阴离子(O₂^·–)；然而，2pq配体的铱(III)配合物在400-500 nm范围内的吸收系数(<6000M^-11cm^-1)不足，导致ROS产生有限(补充表1)，因此，我们在铱(III)光敏剂(Ir-OA)上引入了一种以6-乙酰-2-(二甲氨基)萘为基的能量供体。Acedan衍生物在400 nm(>16000M^-11cm ^-1)处具有强吸收系数，在400-500 nm范围内具有高发射量子产率(>0.90)(补充表1)。能量供体的发射光谱和2pq配体的铱(III)配合物的吸收光谱很好地重叠(补充图10)，允许有效的分子内能量转移(图1a)。Ir-OA的能量供体和受体由于其非共轭桥而独立地吸收光，导致Ir-OA的吸收光谱对应于Ir-OC和化合物4的吸收光谱之和（图1c）。在Ir-OA(λ_ex = 385 nm)中，470 nm处供能体的荧光几乎猝灭；同时，能量受体在555 nm处的发射增强，这强烈表明发生了高效的分子内能量转移(φ能量转移= 98.4%)(图1d)。 

图1 铱（III）光敏剂的光物理特性

a分子工程策略的示意图:分子内能量转移和由此产生的光激活ROS。图示的Ir-OA分子是一种Δ异构体，但是Λ型对映体也可以存在。b Ir-OA、Ir-OC和化合物4的分子结构。c 三种化学物质的紫外可见吸收光谱。d三种化合物的后续发射光谱(λ_ex = 400 nm)。e 用9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)在光照射下的吸光度衰减法测定¹O₂。ABDA被Ir - OA光活化产生的1O2降解。数据以平均值±s.d.( n = 3 )表示。f 二氢罗丹明123 (DHR123)荧光增强法测定O₂^·–。ROS测定条件：[铱(Ⅲ)配合物] = 4μM，[ ABDA ] = 100μM或[ DHR123 ] = 4μM，H₂O∶DMSO = 999∶1 ( v / v % )

2. 体外/活细胞ROS生成

为了验证Ir-OA和Ir-OC产生ROS的能力，我们使用9,10-蒽二基双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)进行了¹O₂生成实验并使用二氢化荷丹明123(DHR123)进行了O₂^·–生成实验。与作为参考光敏剂的Ir-OC、化合物4和[Ru(bpy)₃]²⁺相比，ABDA溶液中的Ir-OA产生了更多的¹O₂ (图1e)；此外，在DHR123实验中，Ir-OA比Ir-OC和化合物4产生更强的O₂^·–(图1f)。这说明更多的三态激子是通过Ir- OA分子内的能量转移产生的，加速了¹O₂的生成和O₂^·–的生成。我们用活性氧指示剂2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H₂DCF-DA)证实Ir-OA的光激活是否在活细胞内产生活性氧(补充图11)。当用Ir-OA和H₂DCF-DA处理HeLa细胞时，在非常弱的光照射(LED阵列，λ = 400 nm, 0.17J·cm²)下，Ir-OA光激活能有效地产生ROS，产生强烈的绿色信号；然而，在相同的条件下，Ir-OC不能有效地诱导ROS信号，因为光能不足以使Ir-OC产生足够的ROS水平。根据细胞内ROS测定(补充图11)，Ir-OA可作为一种有效的光敏剂，诱导活细胞受到强烈的氧化应激，并有望诱导生理功能障碍导致细胞死亡。

3. 铱(III)配合物的定位

Ir-OA和Ir-OC含有阳离子铱核和亲脂性配体，由于线粒体内膜（IMM）的负线粒体膜电位（MMP）而靶向线粒体。我们用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)测定了Ir-OA和Ir-OC的亚细胞定位，并用MitoTracker-Deep-Red（IMM荧光探针）和IMS染色。值得注意的是，CLSM图像与MitoTracker-Deep-Red的图像重叠(Ir-OA的Pearson s系数=0.86，Ir-OC的Pearson s系数=0.74)，这清楚地表明Ir-OA和Ir-OC位于线粒体上（图2a和补充图12）。为了明确Ir-OA在线粒体超微结构中的具体位置，我们进行了Airscan共聚焦成像(~120 nm)。Ir-OA的Airyscan图像也与MitoTracker重叠，显示了与IMM相对应的线粒体的清晰边界；该图像还显示了Ir-OA在IMM外部的定位(图2b)。为了进一步区分Ir-OA的亚线粒体定位，转染线粒体基质靶向Mito-EGFP对Ir-OA进行基质成像(图2c)。Airyscan图像显示Ir-OA主要位于线粒体EGFP信号的外边界，暗示Ir-OA的主要发光群体不在线粒体基质中。超分辨成像结果提示Ir-OA的亚线粒体定位可能是从IMM向IMS和线粒体外膜(OMM)扩散。因此，Ir-OA不仅对线粒体蛋白质产生氧化应激，而且对与线粒体接触的亚细胞器(如内质网和过氧化物酶体)的蛋白质也产生氧化应激，从而引起蛋白质功能障碍、微环境改变和细胞死亡。

图2 Ir-OA在活细胞中的定位

a 用MitoTracker进行Ir-OA共焦成像。Ir - OA (红色)的荧光和MitoTracker (绿色)的荧光以及融合图像( Ir - OA的λ_ex= 405 nm，MitoTracker Deep Red FM的λ_ex= 647 nm)。采用Image J软件计算Pearson s系数( R² = 0.86 )。b Airscan与Ir-OA(红色)和MitoTracker(绿色，线粒体外膜/内膜)的线粒体共焦图像，以确定Ir-OA的具体位置。c Airscan线粒体共聚焦图像，Ir-OA(红色)和Mito-EGFP(绿色，线粒体基质)。对每一个发射信号进行线型分析以明确其具体位置得到相应的图像(右图)，Ir-OA信号与线粒体外/内膜上的MitoTracker信号很好地融合，并与线粒体基质的Mito - EGFP信号。Airyscan图像中的线粒体通过Ir-OA的光激活（λ_ex=405nm，0.0125mw）预膨胀以识别线粒体亚结构（Ir-OA的线粒体膨胀效应在后面解释）。采用卡尔蔡司zen3.0blue软件进行谱线分析。条件：[Ir-OA]=4μM，[MitoTracker Deep Red]=100nm，孵育时间分别为2h和0.5h。所有的成像都被独立地重复三次，每个实验都显示出相似的结果。

4. 线粒体氧化诱导细胞死亡

为了证实通过线粒体内Ir-OA光激活导致的细胞死亡，我们采用CCK-8和MTT法进行细胞毒性定量分析，并使用碘化丙啶(PI)(死亡细胞指标)和钙黄质AM(活细胞指标)进行活/死实验。在低光能(0.08-0.25 J·cm²)下，Ir-OA光激活后，细胞活力显著下降(图3a，补充图13，补充表2)；然而，Ir-OC无法引起细胞活力的显著变化，因为在相同的条件下，产生的ROS水平不足以触发细胞死亡。值得注意的是，用CCK-8法测定Ir-OA的IC₅₀值明显高于用MTT法测定的IC₅₀值(补充表2)。这是因为MTT法中形成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜依赖于线粒体脱氢酶，而CCK-8是由全细胞脱氢酶激活的，因此，CCK-8法在测定以线粒体为靶点的光敏剂的光毒性方面更为合适和可靠。此外，采用CCK-8和MTT测定Ir-OA的光毒性，此结果与活/死细胞染色试验的结果相一致。在带有Ir-OA的HeLa细胞中，死亡细胞显示出强烈的PI荧光，而在带有Ir-OC的HeLa细胞中，活细胞显示出钙黄素AM的绿色荧光(图3b)。此外，具有Ir-OA的细胞在光照射90分钟内表现出PI信号增强(LED阵列，λ = 400 nm, 0.17J·cm²)，这意味着细胞在不到2小时内开始死亡(补充图14)，可能是由于线粒体的强烈氧化。我们采用荧光激活细胞分选法( FACS )证实活/死细胞的情况，并用二维直方图显示相应的数量(图3c和补充图15 )。当Ir-OA被光激活时，PI阳性、钙黄质AM阴性的HeLa细胞数量显著增加，证实大部分细胞死亡。此外，在细胞膜破坏(PI阳性)之前，Ir-OA光激活后，膜联蛋白V阳性、PI阴性(Q2)的细胞数量增加(图3d和补充图15)，表明死亡的细胞处于早期凋亡阶段。因此，Ir-OA的光激活触发凋亡细胞死亡，而Ir-OC的光激活没有改变细胞活力。

图3 铱(III)配合物光毒性效应的鉴定

a CCK-8法用于定量Ir-OA和Ir-OC在光照射或不照射下对HeLa细胞的细胞毒性。数据以平均值±s.d.表示（n=4）。条件：光敏剂铱（III）配合物孵育时间=2h，光源=400nm光阵列，光剂量：0.085、0.170、0.255J·cm²。b 验证Ir-OA和Ir-OC光毒性的活/死试验。光照后6小时和20小时，分别用碘化丙啶（PI，红色）和钙黄绿素AM（绿色）对死细胞和活细胞进行染色（比例尺=200μm）。条件：[铱（III）配合物]=8μM，光源=400nm LED光阵列，光剂量=0.255J·cm²。实验被独立重复三次，每个实验都显示出相似的结果。c铱配合物孵育HeLa细胞的代表性钙黄绿素AM与PI流式细胞术图。d 铱配合物孵育HeLa细胞膜联蛋白V与PI的流式细胞术图。Q1(右上):晚期凋亡/坏死细胞，Q2(右下):早期凋亡细胞，Q3(左下):活细胞，Q4(左上):坏死细胞。流式细胞术条件:[Ir复合物]= 8 μM，光源= 400 nm LED光阵列，光剂量= 0.25 J·cm²。

5. 蛋白质交联改变线粒体黏度

ROS和随后的氧化应激触发了微环境的变化，如受应激影响的特定区域的黏度和极性。黏度的增加影响了生物分子间的相互作用和代谢物的扩散，从而阻碍了线粒体的呼吸和代谢，进而导致细胞死亡。虽然蛋白质交联被认为是黏度变化的可能原因，但此前没有实验证据报道。

通常我们知道ROS会使蛋白质交联，产生蛋白质聚集物，从而增加微环境的黏度。黏度变化可影响铱(Ⅲ)配合物的寿命，寿命变化采用时间相关单光子计数( TCSPC )测量。首先，在甲醇和甘油中测定了Ir- OA磷光寿命的黏度敏感性。随着甘油含量(v/v)从0% (0.55 cP)增加到95% (950 cP)，Ir-OA的磷光寿命从278 ns增加到2293 ns(图4a和补充图16)。此外，我们证实了局部区域蛋白浓度的增加导致了Ir-OA的磷光寿命的增强，将牛血清白蛋白(BSA)以0.0156、0.0625、0.250、1.00、4.00 mg/mL的浓度溶解在Ir-OA水溶液中(补充图17)。Ir-OA的荧光寿命由664±31ns增加到1912±40ns，呈浓度依赖性。这一结果表明，通过Ir-OA的磷光寿命的变化可以监测到光交联引起的蛋白质的局部积累以及相应的黏度增加。因此，在HeLa细胞中，我们使用磷光寿命成像显微镜(PLIM)监测Ir-OA引起的氧化应激产物线粒体黏度的变化(图4b)。具有Ir-OA的HeLa细胞在光照射前的平均寿命为866 20 ns (LED阵列，λ = 400 nm, 0.17 J·cm²)，而在光照射后则增加到915±14 ns，这可能是由于交联蛋白的积累。然后，我们进一步研究了Ir-OA是否能成功诱导活细胞的蛋白交联(LED阵列，λ = 400 nm, 1.28 J·cm²)。此外，Ir-OA的光交联反应在各细胞器中都得到了证实。首先，我们转染了四种不同的EGFP结构体(Mito-EGFP：线粒体基质；Sec61b-EGFP：内质网膜；PEX16-EGFP：过氧物酶体;和PTBP1-EGFP：细胞核)(补充表3)，然后在有光或无光条件下培养Ir-OA。Mito-EGFP、Sec61b-EGFP和PEX16-EGFP在光照下(hv+)观察共价交联EGFP的Western blot信号(图4c-f，左和补充图18)。然而，由于细胞核离线粒体较远，且无直接接触位点，因此在核内光激活Ir-OA(PTBP1-EGFP)后，抗EGFP凝胶上的信号没有改变。

通过线切割分析比较光的存在和缺失，我们得到了相关值(R²)，并用它来计算交联效率(η)(计算细节在补充信息中解释)(图4c-f)。光交联在内质网膜(η = 60.3%)、线粒体基质(η = 33.2%)和过氧化物酶体(η = 20.6%)中表现明显，但在细胞核(η = 1.0%)中表现不明显。各细胞器的Ir-OA与EGFP接触的可能性影响交联效率的差异。因此，我们再次转染了四种不同的EGFP构建体，并用Ir-OA对EGFP进行成像以研究它们的接近性(图4c-f，右)。我们计算了各图像的Pearson s系数R 值(与Ir-OA相比较，Mito-EGFP，R = 0.907；Sec61b-EGFP，R = 0.477；PEX15-EGFP，R = 0.124；PTBP1-EGFP，R = 0.347)。我们考虑到更接近Ir-OA的EGFP更容易交联，可以推断线粒体基质、内质网膜和过氧化物酶体中的EGFP比细胞核中的EGFP更易交联。值得注意的是，内质网膜蛋白的交联效率比线粒体基质蛋白和过氧化物酶体蛋白更显著，因为Ir-OA位于OMM和IMM的外表面。内质网膜蛋白与Ir-OA直接接触，而线粒体基质蛋白与Ir-OA的接触受到IMM的限制，因此，Ir-OA分子在ER膜中触发的蛋白交联相对于线粒体基质中触发的蛋白交联较多。此外，我们在HeLa细胞中测定了EGFP的交联效率，其趋势与HEK293T细胞相似(补充图19)。蛋白质交联可能是通过诱导线粒体或线粒体接触细胞器蛋白(即线粒体基质蛋白、内质网膜蛋白和过氧化物酶体蛋白)的聚集来增加细胞黏度的一种可能途径。蛋白质交联诱导的黏度线粒体环境可以通过降低生物分子的扩散和反应速率来影响扩散介导的细胞过程，如线粒体代谢、运输和信号传递。因此，线粒体局部黏度的增加加速了细胞死亡。

图4 Ir-OA光活化光交联改变线粒体黏度

a Ir-OA寿命中黏度依赖性的变化。体外黏度可由甲醇中甘油含量(v/v，%)的0% ~ 95%精确控制。数据以平均值±s.d表示(n = 3)。b 光照射前后Ir-OA在线粒体中的磷光寿命成像(PLIM)。所描述的寿命是在相同条件下(n = 3)获得的三幅图像的平均值。c-f Western blot(左)鉴定了四种不同细胞器的Ir-OA蛋白光交联:c线粒体(Mito-EGFP)；d ER (Sec61B-EGFP)；e过氧物酶体(PEX16-EGFP)；f核(PTBP1-EGFP)。Ir-OA（红色信号）和每个EGFP（绿色信号）的共定位图像（右）。λ_ex=405nm和488nm（分别为Ir-OA和EGFP）。使用Image J软件（Mito-EGFP，R=0.907；Sec61b-EGFP，R=0.477；PEX15-EGFP，R=0.124；PTBP1-EGFP，R=0.347）计算具有Ir-OA的各个细胞器的Pearson系数。对有无光照射的Western blot信号进行线切割分析(下)，以量化交联效率( η ) ( n = 3 )。表示相似度的每个相关值( R² )都写在线切割谱上方。值得注意的是，对于Ir - OA显著的OMM / IMM定位，ER的定位效率高于线粒体。所有成像和印迹实验独立重复三次，每个实验显示相似的结果。

6. 线粒体去极化和相关的氧化蛋白质组

线粒体氧化应激触发线粒体去极化，即MMP的崩溃。为了监测线粒体去极化的变化，我们使用了分子内能量转移，因为其效率高度依赖于周围的极性，从而提供了比率发射特性(图5a)。在纯MeOH溶剂中，由于Ir-OA (λ_ex= 400 nm，供体吸收最大值)在相对疏水的条件下分子内能量转移效率较低，导致Ir-OA的受体发射(λ_em =555 nm)较弱，能量供体发射(λ_em =450 nm)较强(图5b )。但是，随着极性的增加，受体的发射(λ_em =555 nm)逐渐增强，而供体的发射(λ_em =450 nm)逐渐减少，从而导致能量的有效传递。这是因为亲水性环境的增加迫使能量供体(acedan衍生物)通过π-π相互作用向铱配体靠近，从而提高了能量转移效率(见补充信息和补充图20)。我们还通过lambda扫描确认了细胞内根据极性变化的发射强度剖面(补充图21)。

利用这一特性，我们用CLSM表示了监测氧化应激下线粒体去极化的比值图像(比值=受体的发射，λ_em=573-620 nm/供体的发射，λ_em=420-480 nm)(图5c)。在未诱导氧化应激的情况下，具有Ir-OA的HeLa细胞线粒体保持了较高的线粒体极性(红色，高MMP)；相反，大多数线粒体在光激活后90分钟(0.17 J·cm²)内逐渐去极化(蓝色，低MMP)(图5c顶部)。此外，在连续的光活化下，在实时分析中，Ir-OA的发射比在30秒内呈现出快速的变化(从绿色到蓝色)，这意味着过度氧化应激导致了快速的线粒体去极化(图5c底部和补充1)。为了支持这一观点，我们使用检测MMP的常规染料——四甲基罗丹明乙酯(TMRE)来确定线粒体去极化的时间范围。在有Ir-OA的HeLa细胞中，光激活30分钟后TMRE信号完全熄灭(补充图22)，因此，我们认为被大量ROS氧化的蛋白是强而快速去极化的主要原因。

为了鉴定受去极化显著影响的蛋白，我们对整个细胞中氧化的蛋白质组进行了分析，因为严重的蛋白质氧化是蛋白质功能障碍的关键诱导点之一。由于蛋氨酸是一种常见且容易氧化的氨基酸，因此我们分析了全细胞蛋白质组中的氧化蛋氨酸（O-Met）的情况（补充数据）。首先，通过非标记定量蛋白质组学（p值<0.1）我们对具有大量O-Met的蛋白质组进行分选（图6a）。光活化Ir- OA对蛋白质的氧化主要发生在线粒体、ER和囊泡中，细胞质和细胞核中的蛋白质也被部分氧化，这与交联效率的结果非常吻合(图6b )。接下来，我们对112个实质性O- Met线粒体蛋白中的28个线粒体蛋白进行了研究。根据其功能可分为:(i)通道和转位酶(ii)氧化磷酸化(OXPHOS)复合物。我们采用热图成像的形式显示蛋白质表达情况(图6c)；其中，我们重点研究了VDAC1、VDAC3和SLC25家族氧化通道和易位酶组，以及ATP5A1和ATP5C1氧化OXPHOS复合体组。通道和转位酶组由于线粒体阳离子交换而直接参与MMP的改变，特别是H⁺和Ca²⁺的交换。VDAC1和VDAC3是必需的OMM蛋白，所有离子和代谢物在到达线粒体内部空间之前必须穿过。离子和代谢物进入线粒体内膜后，由SLC25家族(线粒体载体)运输到基质。

在SLC25家族成员中，有五种蛋白质(SLC25A3、SLC25A5、SLC25A6、SLC25A10、SLC25A24)也被显著氧化。总的来说，Ir-OA光激活实质上破坏了MMP，这是由于线粒体外膜和内膜上两个具有代表性的门控蛋白被严重氧化，干扰了离子或转运代谢物的运动。OXPHOS复合物是Ir-OA光激活后可能发生的线粒体极性变化的另一个靶点，OXPHOS复合物参与了绝大多数ATP的产生和H⁺在IMS和基质之间的流出/流入。ATP5A1和ATP5C1是OXPHOS复合体V的组成部分，负责H⁺内流，而H⁺内流仅由OXPHOS复合体V驱动。因此，随着Ca²⁺失衡，H⁺梯度塌陷也有助于线粒体去极化。电压依赖性阴离子通道（VDAC1），OXPHOS络合物I基质臂（NDUFS1和NDUFA9）和OXPHOS络合物III（CYC1和UQCRC1）的晶体结构被报道具有O-Met位点(图6d)。此外，上述VDAC1、VDAC3和OXPHOS复合物与凋亡密切相关，每种关键蛋白的氧化应激可能与氧化诱导的细胞死亡加速有关。因此，我们得出结论，Ir-OA光激活氧化不仅显著影响线粒体去极化，而且还影响其他线粒体功能和生理。

图5 Ir-OA光活化的线粒体去极化

a 图解说明了依赖极性的能量转移效率的变化和(b)以下比率发射性质的变化取决于水:甲醇的比例。c HeLa细胞在氧化应激下的Ir-OA比率CLSM成像。在氧化应激暴露后0,10,45和90分钟观察到比率发射（LED阵列，λ=400nm；光剂量=0.17J·cm ²）（顶部，比例尺=50μm），并且线粒体极性变化为在60秒内（底部，比例尺=20μm）通过光活化期间的实时比率成像进行监测。CLSM仪器的激光激发Ir-OA用于实时成像（底部）。比率=（受体的发射，λ_em=573-620nm/供体的发射，λ_em=420-480nm）。具有高MMP的正常线粒体：红色（顶部）和绿色（底部）。所有成像独立重复三次，每个实验显示相似的结果。

 

图6 线粒体去极化相关蛋白质组学

a 定量分析氧化蛋白质组火山图。基本上氧化的蛋白质组在log2（倍数变化）>0和logP值>1（浅蓝色区域）的范围内分选。b 氧化蛋白质组在各种细胞器中的比例。使用UniProt确定蛋白质组的位置，并用由1158个人类基因组成的人类MitoCarta2.0数据集交叉检查线粒体蛋白质。获得的比例（%）为每个细胞器中显着氧化的蛋白质组数（logP>1）与整个氧化的蛋白质组数（logP>0）之比。c 对112个基本氧化的线粒体蛋白中的28个线粒体蛋白进行非标记定量(LFQ)热图(补充数据)。d 三种具有代表性的氧化蛋白;OXPHOS配合物I (NDUFS1和NDUFA9)，OXPHOS配合物III和电压依赖性阴离子选择性通道1 (VDAC1)。

7. 线粒体形态变化的监测

线粒体形态变化和明显肿胀是细胞死亡进程的决定性证据。我们利用光照期间的延时成像(14 mW，405 nm激光扫描显微镜)实时记录线粒体形态(图7a, b)。有趣的是，大多数线粒体的形状在180s内呈圆形，线粒体基质肿胀，分裂融合频繁(图7a、b和补充2-4)。在我们的O-Met蛋白组中，有几种蛋白酶和伴侣蛋白被氧化(图7c)，这可能损害它们消除和恢复未折叠或者错误折叠线粒体蛋白的功能。因此，受损蛋白质积累并触发了相应的线粒体裂变/融合和肿胀。裂变/融合被称为蛋白质质量控制过程，可能与线粒体/内质网蛋白酶和伴侣的氧化有关；因此，由于蛋白质水解功能障碍导致线粒体内受损蛋白质的积累，裂变/融合超载，这一现象与O-Met蛋白组中未观察到参与分裂和融合的蛋白相对应(图7d)。此外，线粒体基质肿胀可以解释为OXPHOS和通道蛋白的氧化导致离子失衡(图7e)。OXPHOS复合体I的功能障碍必然会增加NADH水平，导致VDAC闭合，增加基质Ca²⁺浓度；此外，LETM1的氧化使Ca²⁺水平升高，参与Ca²⁺外流。OXPHOS功能障碍引起的基质内Ca²⁺的积累、线粒体去极化和ATP耗竭可能触发线粒体通透性过渡孔(MPTP)打开，加速离子、水和其他溶质的流入。因此，MPTP的打开使线粒体基质膨胀，通过废除OMM释放细胞死亡因子而导致细胞死亡(图7e)。

图7 线粒体形态监测和提出的细胞死亡机制

a 左为照射前(14mw，激光扫描显微镜405nm激光)和照射204s后(右)的Ir-OA HeLa细胞照片。为了监测形态变化，通过Mito-EGFP（绿色信号）转染线粒体基质（比例尺=10μm）。白色框表示线粒体裂变和融合。该实验独立重复三次，每个实验显示相似的结果。B 图7a中白盒的放大延时图像(0-340秒)。在分裂和融合的同时，也观察到线粒体肿胀。c 蛋白酶和线粒体分裂及融合相关蛋白氧化的研究。对O-Met蛋白相关线粒体蛋白质量控制的热图，此外d 裂变和聚变。e 线粒体环境变化的机制简介。这说明了线粒体氧化应激的蛋白质组学分析对线粒体氧化应激的影响。f 基于现象学观察和蛋白质组学分析的线粒体氧化诱导细胞死亡机制描述。

讨论

基于现象学监测和蛋白质组学分析，我们提出了从线粒体氧化应激到细胞死亡的机制（图7f）。首先，ROS使线粒体周围的蛋白质交联，从而增加了微黏度。OMM/IMM周围的黏性环境降低了代谢物的扩散和生理反应速率，破坏了代谢物介导的线粒体功能，包括ATP生成、线粒体蛋白合成和ROS减少。此外，ROS氧化负责维持MMP的蛋白质（OXPHOS复合物和通道&转位酶），引起蛋白质的严重功能障碍并导致线粒体去极化。氧化蛋白诱导Ca²⁺在基质中积累，导致MPTP开放，引发线粒体明显肿胀，伴随分裂和融合，随后细胞死亡。总的来说，线粒体对氧化应激的反应，如黏度增强、去极化，以及随后的线粒体肿胀对细胞死亡具有协同作用。

本文利用基于分子内能量转移的分子设计策略，我们报道了产生强烈ROS的铱（III）光敏剂Ir-OA，诱导线粒体氧化诱导的细胞死亡。Ir-OA的光物理特性可应用于各种成像技术，以监测线粒体对强氧化应激的瞬时反应。有趣的是，由于氧化应激导致线粒体周围蛋白交联、通道和转座子相关的线粒体蛋白被氧化以及OXPHOS复合物，导致微黏度增加和去极化。此外，我们观察到MPTP通过Ca²⁺积累、去极化和ATP耗竭而开放，从而显著肿胀，这加速了细胞死亡。此外，线粒体/内质网蛋白酶的氧化导致受损蛋白的积累，进而造成线粒体分裂/融合。

结论

简单地说，我们采用光敏剂进行现象观察和蛋白质组学分析，提出了一个从线粒体氧化应激到细胞死亡的潜在机制。这些结果提示线粒体光敏影响细胞存活的一种方式，我们希望这些结果将有助于提供线粒体氧化相关疾病的基本理解，以及诱导氧化应激的癌症治疗。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33397915/