科研 | 香港大学：LOXL4在肝癌发生过程中促进免疫抑制微环境
编译：李华瑶，编辑：Emma、江舜尧。
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已有研究表明肝细胞持续的炎症，可在细胞和分子水平上引起多种改变，最终导致遗传不稳定，随后形成肝脏部位的癌前病变而启动实质细胞向肿瘤转化。同时，对于检测和消除转化细胞非常重要的因素，包括驻留在肝脏微环境中或已经渗透到肝脏微环境中的固有和适应性免疫细胞，这些细胞的基因在肿瘤形成过程中受到损害。赖氨酰氧化酶样蛋白4(lysyl oxy-like 4，LOXL4)是一种主要参与细胞外基质重塑的胺氧化酶，在肝细胞癌组织中高表达，LOXL4由肿瘤细胞分泌，主要通过外切体内化定位于肝巨噬细胞内。在本研究中，通过同时喂食胆碱缺乏的L-氨基酸限定(CDAA)饮食，我们证明了在小鼠肝癌变的过程中，小鼠肝脏的LOXL4表达增加。我们的研究显示，巨噬细胞体外暴露于LOXL4时可引起免疫抑制表型，并激活PD-L1的表达，进而抑制CD8+T细胞的功能。通过注射LOXL4可促进巨噬细胞向肝脏浸润，加速肿瘤生长，T细胞转移或PD-L1中和可进一步消除这种作用。蛋白质组学分析表明，LOXL4对巨噬细胞的免疫抑制作用主要依赖于IFN介导的STAT3依赖的PD-L1活化，过氧化氢清除或铜螯合巨噬细胞可阻断干扰素介导的LOXL4介导的PD-L1递呈。在人肝癌组织中，CD68细胞中LOXL4的表达与PD-L1水平呈正相关，并且CD68细胞中LOXL4的高表达和肿瘤组织中CD8+T的低表达共同预示着HCC患者的生存不良。总之，LOXL4表达上调是肝癌发生的功能介质，对慢性肝病患者肝细胞癌的发生有潜在的临床预测价值。我们的研究揭示了LOXL4在肝癌发生过程中促进免疫抑制微环境的作用。
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实验设计
1. 人类样本
从美国马里兰州Biomax(HLiv-HCC180Sur-03)获得包含90对人HCC组织和邻近正常肝组织的组织块，以及包括2.3~7年随访时间的生存数据。组织收集来自于2010年1月至2011年9月期间进行手术的患者。
2. 动物实验
采用美国Charles River实验室(MA)的Balb/Cann-nu小鼠建立原位肝癌模型，如前所述，所有小鼠维持12小时光照和12小时黑暗周期，每周测量体重并记录，C57BL/6J小鼠由美国Jackson实验室提供，四周龄的C57BL/6J小鼠喂以胆碱缺乏、L-氨基酸定义(CDAA)的饮食(美国宾夕法尼亚州DyetsInc.)，并进行腹腔注射，每周注射两次四氯化碳。所有小鼠均饲养在香港大学无病原体实验动物室。在此详述的动物程序和辅助方法已通过香港大学活体动物教学及研究委员会批准。
实验结果
1. LOXL4在肝癌发生过程中呈高表达
我们及其他研究均表明，CDAA饮食诱导的啮齿动物肝肿瘤可以准确地模拟人类肝脏的癌变过程，CCl4可通过促进肝脏炎症、纤维化和肝细胞膨胀来促进肝癌的发生。在本研究中，我们利用CDAA+CCL4诱导的C57BL/6J小鼠肝癌模型检测了LOXL4的表达，并以CSAA饮食喂养的啮齿动物作为对照。接受CDAA+CCL4治疗的小鼠肝脏在1-3个月时出现广泛的脂肪变性，6个月时发展为肝硬化，6-9个月时发展为肝肿瘤，这一模式在我们的研究中一直被观察到。随后在喂养CDAA饮食3个月、6个月和9个月的小鼠中检测不同类型免疫细胞的浸润情况。CD45+白细胞浸润在肝癌发生的非肿瘤性阶段的前6个月明显增加，反映了人肝癌早期肝脏持续的慢性炎症。有趣的是，白细胞浸润在肿瘤形成阶段变得不那么明显，这表明肝脏微环境发生了变化，导致了肝脏免疫微环境的变化。然而，在肝癌发生过程中，F4/80+巨噬细胞、CD11c+树突状细胞和CD3+T淋巴细胞亚群持续增加(图1A)，然而，F4/80+TIM-4+Kupffer细胞亚群在9个月时减少，提示肿瘤发生时驻留巨噬细胞已耗尽。为了确定LOXL蛋白在肝癌发生过程中的作用，我们首先研究了LOXL蛋白在肝癌组织和邻近肝组织中的表达。我们发现，在HCC组织中观察到LOXL4的表达显著增加，并与肝癌患者的低存活率相关(图2)，但没有发现LOXL1-3的表达。在肝癌变的啮齿动物模型中，LOXL1和LOXL3的mRNA水平在炎症阶段升高，在肿瘤发生阶段下降，而LOXL4的mRNA水平在肿瘤发生阶段显著升高(图1B)，在啮齿动物模型中未检测到LOXL2。此外，在接受CSAA治疗的小鼠肝脏中，LOXL4的表达没有发现明显的时间变化，这表明LOXL4的上调是一种与发病相关的现象，可能与衰老无关。在肝癌变的啮齿动物模型中，9个月发生肿瘤的小鼠肝脏中LOXL4蛋白的表达显著高于6个月未发生肿瘤的小鼠，进一步支持了LOXL4可能参与形成致癌肝脏微环境的假设(图1C)。免疫荧光染色显示LOXL4蛋白与小鼠巨噬细胞的特异性标志物F4/80大量共存，但不与代表其他免疫细胞的细胞表面标志物共存(图1D)。这些观察表明，LOXL4参与了肝癌发生过程中巨噬细胞的形成。
图1 肝细胞癌变过程中巨噬细胞表达LOXL4
(A)肝癌发生过程中免疫细胞的瘤内情况。CDAA饮食喂养3、6或9个月的小鼠(每组10只)CD45+、CD45+、F4/80+巨噬细胞、Gr1+粒细胞、CD11c+树突状细胞、CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞(占肝白细胞的百分比)的定量。(B)3、6和9月龄CDAA或CSAA饮食小鼠肝脏中LOXL1、3和4的表达水平。(C)3、6、9月龄CDAA或CSAA喂养小鼠的LOXL4蛋白表达。(D)9月龄CDAA饮食小鼠F4/80+巨噬细胞、CD3+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞、CD103+树突状细胞、CD31+内皮细胞和SMA+成纤维细胞中LOXL4共染色。（E）用模拟和LOXL4敲低的Hepa 1-6细胞衍生的外泌体体外处理的BMDM中LOXL4的蛋白表达。（F）HCC组织（n = 360）中LOXL4的mRNA表达与其拷贝数呈正相关（r = 0.21，P = 6.591e-5，Spearman秩相关检验），但与DNA甲基化状态呈负相关（r = -0.46，P = 2.28e-20）。*P<.05；**P<.01；*P<.001；N.S.，无统计学意义；DC，树突状细胞；BMDM，骨髓源性巨噬细胞；KD，基因敲除。
已有多条证据表明LOXL4可能在人肝癌中起致癌作用。为了进一步确定其作用及调控机制，我们比较了LOXL4在致瘤小鼠的mRNA表达，与其蛋白定位相反，LOXL4mRNA在F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中未检测到，但在F4/80-肝实质细胞中高表达，而来自肿瘤和非肿瘤区域的F4/80+ACC巨噬细胞中LOXL4的表达变化不大。另外，观察到BMDMs表达微量的LOXL4mRNA，而在小鼠肝细胞和肝癌细胞系HEPA1-6中检测到更高水平的LOXL4mRNA，进一步证明了这一结论。鉴于先前的一项研究报道肝癌细胞可能分泌携带LOXL4的外切体，我们得出假设，肿瘤细胞衍生的外切体被巨噬细胞内化，从而导致细胞内LOXL4水平的增加。事实上，在来自HEPA 1-6细胞的外切体中观察到LOXL4蛋白，并可被BMDM吸收，但没有观察到mRNA。表明HEPA1-6细胞来源的外切体的内化增加了BMDM中的LOXL4蛋白水平，而来自LOXL4基因敲除的HEPA 1-6细胞的外切体的内化导致了BMDM中LOXL4蛋白水平的降低(图1E)。然后，我们探讨了导致肝细胞癌中LOXL4过表达的可能机制，通过从肿瘤基因组图谱(TCGA)检索数据，我们发现肝癌组织中LOXL4mRNA的表达与拷贝数呈正相关，此外，LOXL4的mRNA水平与其DNA甲基化状态呈负相关（图1F），DNA去甲基化试剂5-氮杂胞苷可显著诱导肝癌细胞LOXL4mRNA表达。总之，这些观察表明肝癌的发生过程涉及肿瘤细胞通过表观遗传调节LOXL4的过度表达。
2. 肝脏中LOXL4的促肿瘤作用需要巨噬细胞的参与
为了研究LOXL4的作用，我们使用腺病毒(AAV)基因转移技术有条件地敲除LOXL4在原位小鼠肝癌模型中的表达，由AAV8递送的针对LOXL4靶标的shRNA可特异性地沉默LOXL4在小鼠肝脏中的表达(图2A)。与先前的研究一致，肝LOXL4敲除的小鼠表现出每周肿瘤生长减慢，肝脏肿瘤体积和微血管密度减少(图2A)，与AAV8干扰shRNA处理的阴性对照小鼠相比，在LOXL4基因敲除的小鼠中，CD11b+F4/80+TAMS群体的肝脏浸润明显减少(图2B)。肝癌细胞中LOXL4的沉默在体外显示出，细胞存活及增殖减少，而在长期培养中没有生长差异。尽管如此，补充rLOXL4对肝癌细胞的增殖和存活的影响微乎其微，提示肝癌细胞内过表达LOXL4支持细胞增殖，而分泌型LOXL4可能作用于肿瘤微环境。
为了证实这一点，我们将rLOXL4腹膜内注射到小鼠肝癌的原位模型中（支持图S5A）。鼠rLOXL4的注射增加了TAM中LOXL4的蛋白水平，并导致肝脏中原位肿瘤的加速生长（图2C），而小鼠的食物摄入量和体重却保持不变（支持图S5A）。此外，rLOXL4注射显着增加了肝微环境中CD11b + F4 / 80 + TAM的数量（图2D），其中，TAM的扩增是由单核细胞浸润或局部增殖引起的。随后，我们在腹膜内注射了PKH26染色的骨髓单核细胞，发现rLOXL4注射有效增加了TAM的PKH26+群体，而BrdU染色显示由LOXL4诱导的驻留巨噬细胞增殖极小（图2E）。这些数据表明LOXL4诱导的TAM升高主要归因于单核细胞浸润。
图2 LOXL4通过增加TAMS浸润促进肝癌生长
(A)AAV8-shSrc或shLOXL4干预(每组8只)小鼠的肉眼肿瘤生长和肝/体重比(%)。(B)原位荷瘤小鼠CD11b+、F4/80+巨噬细胞(占肿瘤浸润白细胞的百分比)的定量。(C)(i)注射赋形剂或rLOXL4对原位小鼠肝脏LOXL4蛋白表达的影响。(ii)接受赋形剂或rLOXL4注射的原位肝癌免疫耐受和免疫活性小鼠的肉眼肿瘤生长情况，肿瘤直径和肝脏/体重比(%)的量化显示在右侧。(D)原位荷瘤小鼠(n=10)CD11b+、F4/80+巨噬细胞(占肿瘤浸润白细胞的百分比)的定量。(E)用PKH26和BrdU标记，流式细胞仪检测TAMs的浸润(i)和局部增殖(ii)。*P<.05；**P<.01；N.S.，无统计学意义。
为了进一步了解LOXL4在调节巨噬细胞中的作用，我们在体外成熟过程中用rLOXL4补充了BMDM，发现rLOXL4补充在BMDM成熟的早期显着增加了F4 / 80 +种群；然而，这种作用在后期变得不那么明显，表明LOXL4可能加速了巨噬细胞的成熟。此外，rLOXL4的补充有效诱导了MCP-1的表达，从而导致BMDM的运动性增强。为了证实巨噬细胞的参与，我们将氯膦酸脂质体用于消除原位肝肿瘤小鼠的TAM，不管rLOXL4处理如何，注射脂质体氯膦酸盐都能成功清除患有肝肿瘤的小鼠的TAM，显示rLOXL4促进肿瘤生长的作用微不足道（图3A）。由于LOXL4在HCC细胞中的内源表达直接诱导细胞增殖，因此我们将rLOXL处理的BMDM进行过继转移至LOXL4消融的荷瘤小鼠中，以证实LOXL4诱导的巨噬细胞对HCC生长的作用，与过继物处理的BMDM相比，rLOXL4处理的BMDM的转移显着加速了肝脏原位肿瘤的生长，这表明LOXL4在调节体内HCC生长中，在巨噬细胞中的调节起主要作用。这些发现表明LOXL4在肝癌中的致癌作用需要巨噬细胞的存在和调节。
3. LOXL4塑造巨噬细胞的免疫抑制表型
一项研究假设显示，募集巨噬细胞产生促炎因子进而促进转化的上皮细胞的生长，这些被激活的巨噬细胞本应杀死异常细胞，在肿瘤微环境中可被重新分化为具有促进肿瘤的M2表型的细胞，然而，我们观察到在rLOXL4处理的巨噬细胞中M2型巨噬细胞标记CD206的表达没有显著变化，这一结果进一步得到了M2细胞因子如白细胞介素10和转化生长因子β的未改变的表达的支持。有趣的是，我们随后观察到rLOXL4处理基本上维持了分化的BMDM上的Ly6C细胞表面的标记(图3B)。由于先前的一项研究表明高水平表达Ly6C的巨噬细胞表现出免疫抑制特性，我们从rLOXL4处理的BMDM中分离出Ly6C+和Ly6C-群体，rLOXL4可促进Ly6C-和Ly6C+巨噬细胞免疫抑制基因的表达，且在Ly6C+细胞中的作用更为显著(图3C)。另外，观察到rLOXL4处理的巨噬细胞与CD8+T细胞共培养时，可显著降低T细胞增殖，进一步支持了rLOXL4处理的巨噬细胞的免疫抑制特性。颗粒酶B和Ki-67的细胞内染色，是激活的细胞毒性T细胞的一个特征，显示与rLOXL4处理的巨噬细胞共培养阻止了细胞毒性T细胞的激活(图3D)。同样，从rLOXL4治疗的原位肝肿瘤小鼠中分离出的TAMS对T细胞的增殖和激活显示出显著的抑制作用(图3E)。表明rLOXL4单独对细胞毒性T细胞的直接激活作用最小。
图3 LOXL4促进巨噬细胞对CD8+细胞毒T细胞的免疫抑制作用
(A)克罗膦酸盐脂质体干预对照组和rLOXL4处理组小鼠肝肿瘤的荧光素酶强度信号。对照组和rLOXL4治疗组小鼠(每组8只)的宏观肿瘤生长和肝/体重比(%)与氯膦酸盐脂质体干预组小鼠的肿瘤生长和肝/体重比(%)有关。克罗膦酸盐脂质体干预下对照组和rLOXL4处理组小鼠肝脏中CD11b+F4/80+巨噬细胞(占肿瘤浸润白细胞的百分比)的定量。(B)用rLOXL4(100 NM)处理培养的骨髓基质细胞24h，用载体或rLOXL4对CD11b+F4/80+骨髓基质细胞进行Ly6C表达的定量检测，并用流式细胞仪检测Ly6C在CD11b+F4/80+骨髓基质细胞中的表达。(C)检测FACS分选的Ly6C-和Ly6C+BMDM中iNOS和STAB1mRNA的表达水平。(D)CFSE标记的颗粒酶B+或Ki-67+脾脏CD8+T细胞(经抗CD3/CD28抗体刺激)与载体或rLOXL4处理的BMDM共培养的代表性直方图。阳性细胞的百分比显示在右侧面板中。(E)与FACS分选的TAMs共培养的CD8+、CD8+颗粒酶B+和CD8+Ki-67+T细胞的数量测定(CFSE标记的CD8+、CD8+颗粒酶B+和CD8+Ki-67+T细胞与FACS分选的TAMs共培养)。*P<.05；**P<.01；*P<.001；N.S.，无统计学意义；Lip.，克罗膦酸盐脂质体。
T细胞的激活需要L-精氨酸，它由巨噬细胞中的精氨酸酶-1和诱导型一氧化氮合酶(INOS)代谢，我们观察到rLOXL4对巨噬细胞中精氨酸酶-1的表达影响很小，但显著增加了巨噬细胞中的iNOS的表达。然而，补充L-精氨酸或抑制iNOS都不能恢复T细胞的增殖，或细胞内Ki-67和颗粒酶B的表达，提示LOXL4对免疫抑制巨噬细胞的调节机制不依赖于精氨酸。
4. PD-L1介导LOXL4诱导的巨噬细胞免疫抑制
巨噬细胞通过不依赖L-精氨酸的多种机制促进肿瘤微环境中的免疫抑制。巨噬细胞通过PD-L1/PD-L2和CD86/CD80等细胞抗原与杀瘤T细胞相互作用，使T细胞活化，导致功能衰竭。因此，我们研究了LOXL4是否参与了肝癌生长过程中巨噬细胞的免疫检查点调节，在体外，rLOXL4可显著诱导骨髓基质细胞中PD-L1和CD86的表达，而不是PD-L2或CD80的表达(图4A)，此外，rLOXL4诱导巨噬细胞PD-L1和CD86的作用具有剂量依赖性。有趣的是，补充rLOXL4或耗尽LOXL4都不能诱导肝肿瘤细胞中PD-L1和CD86的表达，提示LOXL4的作用是巨噬细胞所特有的。用rLOXL4处理BMDM显著增加PD-L1mRNA的表达(图4B)，表明LOXL4在转录上激活了PD-L1，用中和抗体阻断rLOXL4处理的巨噬细胞中的PD-L1，显示恢复了共培养的T细胞的增殖和激活(图4C)。为了确定PD-L1是否介导了体内免疫抑制和致瘤效应，我们使用抗PD-L1中和抗体来阻断TAM表达的PD-L1在原位肝肿瘤小鼠中的表达。我们过继转移脾脏T细胞以重建荷瘤裸鼠的免疫微环境，我们发现过继转移72h后，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的T细胞回到原位肿瘤中，rLOXL4治疗降低了小鼠肝肿瘤中CD3+T细胞的数量(图4D)，并减弱了过继T细胞转移的杀瘤作用，此外，抗PD-L1中和抗体显著恢复了T细胞相关肿瘤的消退(图4E)。总而言之，这些发现表明LOXL4对TAMS的免疫抑制作用需要PD-L1呈递。
图4 经LOXL4处理的巨噬细胞对细胞毒性T细胞的免疫抑制作用依赖于PD-L1
(A)用赋形剂或rLOXL4处理后，检测具有代表性的BMDMs的PD-L1、PD-L2、CD80和CD86的表达。F4/80+细胞中该表达的量化显示在右侧。(B)检测赋形剂和rLOXL4对骨髓基质细胞PD-L1mRNA表达水平的影响。(C)CFSE标记的脾脏CD8+、CD8+颗粒酶B+和CD8+Ki-67+T细胞与rLOXL4处理的骨髓基质细胞(加或不加PD-L1中和抗体)共培养。(D)过继转移T细胞小鼠肝脏中CD3+T细胞的定量。(E)来自(i)载体或rLOXL4免疫耐受，以及过继T转移后经或不经PD-L1抗PD-L1治疗的rLOXL4治疗小鼠的典型肝脏肿瘤，以及(ii)经Vehicle或rLOXL4加或不加抗PD-L1治疗的具有免疫能力的小鼠。肿瘤直径和肝脏与体重的比率(%)如右图所示。*P<0.05；**P<0.01；N.S.，无统计学意义。
为了解LOXL4对巨噬细胞PD-L1表达的调控机制，我们采用无标记蛋白质组学方法研究了rLOXL4对骨髓基质细胞内蛋白表达的影响。蛋白表达分析显示STAT1、STAT2、STAT3等STATs表达上调，然而，免疫印迹分析发现，rLOXL4诱导了STAT1和STAT3的激活，而STAT2在BMDM中几乎检测不到(图5A)。先前的一项研究观察到，STAT1-STAT3的异源二聚体可能作为转录因子促进含有IRE-启动子元件的表达，这些元件大多是免疫抑制的，通过药物抑制阻断STAT3或STAT1导致rLOXL4处理的BMDM中PD-L1的表达和转录激活减少(图5B)。此外，rLOXL4处理的巨噬细胞中STATS介导的PD-L1表达的失活取消了其对共培养的细胞毒性T细胞增殖和激活的抑制作用(图5C)。此外，基因集富集分析(GSEA)显示，与干扰素(IFNs)相关信号通路相关的基因受到LOXL4的正调控，大多数与干扰素相关信号传递相关的基因都受到rLOXL4暴露的巨噬细胞的显著调控(图5D)。随后，进一步的验证证实了在rLOXL4处理的BMDM中I型干扰素刺激的基因，如ISG15，CCL5和ICAM1的增加，IFNAR中和抗体阻断I型干扰素相关信号可降低rLOXL4诱导的STAT3和STAT1活化(图5E)，以及I型干扰素刺激基因的表达。因此，rLOXL4诱导的PD-L1表达增加和转录激活也被IFNAR中和抗体减弱(图5F)。
图5 LOXL4通过IFN依赖的STAT1、STAT3信号介导PD-L1反式激活
(A)对载体和LOXL4处理的BMDM进行无标记蛋白质组分析，观察载体剂和LOXL4处理的BMDM中STAT1、2和3折叠蛋白表达的变化。免疫印迹分析证实了rLOXL4处理的BMDM中STAT1和STAT3的蛋白表达。(B)在(i)STATTIC或(ii)氟达拉滨存在的情况下，用rLOXL4处理BMDM，观察PD-L1表达的代表性直方图。右侧显示了在F4/80+细胞中的定量表达，以及在Stattic(5µM)或氟达拉滨(10µM)存在下PD-L1mRNA的表达。(C)CFSE标记的脾脏CD8+、CD8+Ki-67+和CD8+颗粒酶B+T细胞与rLOXL4处理的STAT3沉默的BMDM共培养后定量。(D)(i)骨髓基质细胞中rLOXL4调节基因集的富集分数。(ii)载体和rLOXL4处理的BMDM之间差异表达的IFN信号相关基因的热图。(E)免疫印迹法检测IFNAR1中和抗体对BMDM中STAT3和STAT1蛋白表达的影响。(F)在抗IFNAR1(50µg/ml)存在下，定量检测rLOXL4处理的BMDM中PD-L1的表达和mRNA水平。*p<.05；**p<.01；*p<.001；siSTAT3.，STAT3沉默。
LOXL4催化胺基团的转化，并以铜依赖的方式生成过氧化氢(H2O2)和副产物氨。LOXL4干预以时间依赖的方式显著增加BMDM中H2O2的水平(图6A)，用铜螯合剂四硫钼酸(TTM)处理后，rLOXL4处理的BMDM中H2O2的产生被阻断(图6B)，提示LOXL4增加H2O2需要铜介导的酶促反应，巨噬细胞中H2O2相关的氧化还原失衡可能诱导免疫抑制表型的表达，BMDMs与H2O2直接孵育可显著诱导PD-L1的表达(图6C)，而阻断rLOXL4处理的BMDM中的H2O2则抑制PD-L1的诱导(图6D)。在H2O2清除时，LOXL4对STATS的激活也被阻断(图6D)，提示LOXL4诱导的H2O2激活了IFN相关STATS介导的PD-L1，TTM与铜的螯合作用一致地降低了STAT3和STAT1的激活，以及rLOXL4诱导的PD-L1表达的降低(图6E)。有趣的是，我们观察到LOXL4增加了肝癌细胞中H2O2的水平，但增加的H2O2并没有改变肝癌细胞中STAT1/3的表达(图6F)，提示LOXL4介导的PD-L1表达具有细胞类型特异性，这些观察表明，铜依赖的H2O2的产生是激活干扰素相关的STATS介导的PD-L1在LOXL4处理的巨噬细胞中的原因。
图6 铜依赖的H2O2产生调节LOXL4介导的STATS介导的PD-L1的表达
(A)使用Amplex Red过氧化氢检测试剂盒对经载体和rLOXL4处理的BMDM进行H2O2测定。(i)以红色荧光间苯二酚的平均荧光强度为指标；(ii)测定不同孵育时间内H2O2的产生量。(B)在TTM存在的情况下用rLOXL4处理骨髓基质细胞后的H2O2水平。(C)用0.125 mM H2O2处理骨髓基质细胞后，观察PD-L1表达的代表性直方图。F4/80+细胞中该表达的量化显示在右侧。(D)(i)H2O2水平；(ii)PD-L1表达和(iii)rLOXL4在过氧化氢酶(500U/ml)或NAC存在下处理BMDM后STAT1和STAT3的蛋白表达；(E)rLOXL4在TTM存在的情况下处理HEPA1-6细胞。(F)(i)平均产生H2O2和(ii)用赋形剂或rLOXL4处理的HEPA1-6细胞中STAT1和STAT3的蛋白表达。*p<.05；**p<.01；*p<.001；MFI，平均荧光强度；NAC，N-乙酰半胱氨酸；TTM，四硫代钼酸根。
5. LOXL4加速肝脏肿瘤形成
我们推测LOXL4通过STAT1-STAT3介导的PD-L1活化来触发巨噬细胞的免疫抑制功能，并预期这一作用促进了肝癌的发生过程。然后，我们在CDAA饮食喂养的啮齿动物肝脏肿瘤发生模型中使用了CCl4，在肝硬化开始时(7个月)和肿瘤形成后(9个月)补充rLOXL4，显示rLOXL4处理显著增加了肝脏中的LOXL4水平(图7A)，值得注意的是，当从第7个月开始连续服用rLOXL4 3个月时，补充rLOXL4加速了肿瘤的形成，这种加速也反映在肿瘤大小、肿瘤病变频率和肝脏/体重比的增加上(图7B)。然而，当rLOXL4在显著的肿瘤形成后(9个月)给药时，其效果就不那么明显了，尽管这种模式不能排除相对短期的rLOXL4治疗产生效果的可能性。组织学分析表明，rLOXL4治疗有效地加速了肝脏的肿瘤性转化，其特征包括实体瘤形成、细胞质内含物和小梁形态(图7C)，以及增加致癌的Glypican-3+、增殖的Ki-67+和CD31+CD105+的微血管细胞(图7D)，这种转化伴随着rLOXL4处理的小鼠肝脏中TAMS浸润的增加和CD8+细胞毒性T细胞的减少(图7E)，而CD4+T细胞没有明显变化。同样，我们在rLOXL4处理的小鼠的肝脏中观察到PD-L1和AFP的有效过表达(图7F)。这些发现系统地揭示了LOXL4是促进肝癌发生的一个重要因素。
图7 LOXL4促进CDAA+CCl4处理小鼠肝癌的发生
(A)C57BL/6J小鼠在喂饲CDAA饲料的同时注射CCl4，然后从7个月或9个月开始给予rLOXL4治疗。用rLOXL4处理CDAA饲料喂养1个月或3个月的小鼠，检测肝脏LOXL4蛋白的表达。(B)用rLOXL4治疗1个月或3个月的CDAA饮食喂养小鼠的典型肉眼肿瘤、最大肿瘤大小、表面结节数和肝/体重比(%)。(C)CDAA饲料喂养小鼠的H&E染色分析和生长模式。(D)免疫荧光法检测肝组织中Glypican-3、Ki-67、CD31和CD105的表达水平。(E)用rLOXL4处理1个月或3个月的CDAA饮食喂养的小鼠，测定CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD3+CD4+或CD8+T细胞(占肿瘤浸润白细胞的百分比)(n=10)。(F)免疫荧光法检测肝组织(i)PD-L1和(ii)AFP的表达水平。*P<.05；**P<.01；*P<.001。
6. 肝细胞癌中LOXL4表达上调与预后不良相关
为了确定LOXL4是否与HCC的免疫状况和临床结果相关，我们通过评估包含90名患者切片的组织阵列，比较了LOXL4在肝癌组织和邻近非肿瘤组织中的表达（图8A），观察到LOXL4在肿瘤中的表达显著增加。大约70%的LOXL4+细胞是CD68+TAMs(67.87%±12.03%)，肝癌组织中LOXL4+CD68+细胞明显高于LOXL4+CD68-细胞(图8B)，提示LOXL4主要在HCC的TAM中表达。在CD68+TAMS中，TAMS特异性LOXL4的表达与PD-L1水平呈正相关(图8B)。为了确定LOXL4是否与肝细胞癌(HCC)的免疫状况和临床预后相关，我们评估了LOXL4的表达与患者生存的相关性，CD68+TAMs中LOXL4和PD-L1的联合表达预测肝癌患者的生存，肝癌CD68+细胞中携带LOXL4lo 、PD-L1lo的患者总体生存率高于携带LOXL4hi、PD-L1hi的患者(图8C)。同样，CD68+细胞中CD8Ahi和TAMS特异性LOXL4lo比CD8Alo和TAMS特异性LOXL4hi预测HCC患者更好的生存(图8C)，提示LOXL4介导的巨噬细胞可能影响CD8+T细胞的功能和HCC的临床转归，虽然LOXL4在CD68+TAMs中的表达在不同分期的HCC患者队列中没有显著差异，但在不同分期的HCC患者中，LOXL4的表达没有明显差异(图8D)。进一步亚组分析显示，有肝硬化病史的HCC患者CD68+TAMs中LOXL4的表达高于非肝硬化患者(图8E)。另外，包括LOXL4在内的LOX家族蛋白已被报道以铜依赖的方式催化细胞外基质成分的交联，这通过延缓基质金属蛋白酶诱导的蛋白水解降解促进了纤维化的形成，肝硬化和非肝硬化患者之间LOXL4表达的差异导致我们根据病毒性肝炎状况确定患者的亚组。在HBV阳性患者的肝癌组织中，LOXL4显著过表达，此外，HBV感染的患者显示肝脏LOXL4表达增加。尽管如此，病毒载量类型对LOXL4的表达没有显著影响，因为有HBV或HCV背景的HCC患者都高表达LOXL4，这些数据表明，肝LOXL4的表达是慢性肝炎患者肝细胞癌的共同特征。因此，肝细胞癌中LOXL4的高表达可能意味着免疫抑制的微环境以及令人沮丧的临床结果。
图8 肝细胞癌中LOXL4表达上调与预后不良相关
(A)具有代表性的人肝癌组织和相应邻近健康肝组织的免疫荧光图像，显示LOXL4、PD-L1、CD68和CD8A的表达。(B)LOXL4在(i)CD68+和CD68-细胞中的相对表达，(ii)非肿瘤组织和HCC组织中CD68+细胞的相对表达，(iii)LoxL4在CD68+细胞中的表达(n=83)与其PD-L1水平呈正相关(r=0.2943，P<0.0001)。然后，我们检索了该队列中HCC患者的生存数据，(C)(i)CD68+TAM中携带LOXL4loPD-L1lo的肝癌患者较CD68+TAMs中携带LOXL4hiPD-L1hi的患者生存率高；(ii)肿瘤组织中TAMS特异性LOXL4的低表达和CD8A的高表达协同预测HCC患者的较好生存。(D)定量检测不同分期肝癌患者CD68+细胞中LOXL4的表达。(E)不同肝硬化状态肝癌患者CD68+细胞中LOXL4表达的定量。(F)LOXL4在肝癌发生过程中建立免疫抑制微环境的调节机制。*P<.05；*P<.001；N.S.，无统计学意义；n.a.，不可用。
讨论
本研究表明LOXL4及其下游信号级联在促进肝肿瘤后续进展的免疫抑制微环境中起重要作用，LOXL4的这种作用可能是通过塑造肝脏中的巨噬细胞来实现的，一方面，招募更多的浸润的巨噬细胞，另一方面，调节巨噬细胞呈递抑制性检查点分子PD-L1，这反过来又削弱了细胞毒性T细胞介导的免疫监视。LOXL4在肿瘤发展过程中呈进行性增加，主要表达在肝癌的TAMs中，但也定位于其他间质细胞，如内皮细胞。虽然我们不能排除LOXL4作用于内皮细胞的可能性，但对人肝癌组织的进一步分析显示，大约70%的LOXL4+细胞是CD68+TAMs，提示LOXL4具有潜在的免疫调节功能。进一步证实巨噬细胞参与LOXL4介导的肝癌生长的外在效应：(i)使用脂质体克罗膦酸盐耗尽巨噬细胞导致LOXL4没有明显的促生长作用，(ii)将rLOXL4处理的BMDM转移到LOXL4去除的荷瘤小鼠体内，加速了HCC的生长，这进一步证实了巨噬细胞参与了LOXL4介导的肝癌生长的外在效应。虽然LOXL4直接支持肝癌细胞的内在功能，但我们目前的研究结果表明，LOXL4通过巨噬细胞调节的外在作用可能主导了肝癌的生长和发展。
我们的研究提示LOXL4可能参与了肿瘤的发生过程，并推测外切体LOXL4通过诱导PD-L1递呈形成免疫抑制的巨噬细胞。LOXL4诱导的巨噬细胞PD-L1表达具有统计依赖性(图8F)，通过同源二聚化激活STAT1与巨噬细胞的炎症表型有关。先前的一项研究报道，诱发的STAT3介导的免疫抑制和受损的STAT1驱动的免疫监视有助于免疫逃避调节PD-L1的表达，我们观察到STAT1或STAT3的药物抑制降低了LOXL4对PD-L1的激活。LOXL4可能通过诱导STAT1：STAT3异二聚化来激活PD-L1，事实上，STAT3是PD-L1的转录因子。EBV感染通过增加单核细胞中STAT3的活性来诱导PD-L1的表达，在抗PD-L1治疗期间，阻断髓系细胞中的STAT3可以增强CD8+T细胞的激活。我们的发现一致地观察到，抑制STAT3可以恢复T细胞的功能，而对STAT1的抑制作用不那么显著，尽管两者都降低了PD-L1的激活。STAT1和STAT3如何成比例地介导LOXL4诱导的PD-L1表达尚不清楚，但在激活下游效应方面，STAT3/STAT3同源二聚体似乎比STAT1：STAT3异源二聚体更有效。此外，在没有STAT3的细胞中，STAT1的活性延长，表明STAT3通过负调控促进了STATS的平衡。
用中和抗体阻断I型IFN相关信号，可阻断STATS激活和LOXL4诱导的PD-L1表达，提示I型IFN受体与LOXL4之间的相互作用是激活免疫抑制信号所必需的。进一步分析表明，LOXL4诱导的H2O2激活IFN相关STATS介导的PD-L1，而LOXL4诱导的H2O2对巨噬细胞和肝癌细胞的作用不同，提示IFNAR信号的敏感性可能在LOXL4诱导的细胞类型特异性PD-L1中起重要作用。H2O2作为信使分子通过催化相关蛋白半胱氨酸残基的翻译后修饰来调节激酶活性，并参与JAK的激活，在晚期肝病和肝细胞癌患者的肝组织中有报道干扰素信号受损。恶性肿瘤切片的患者表现出干扰素信号的抑制，提示在恶性肿瘤过程中干扰素信号被选择性地关闭。最近的研究报道肝癌患者携带至少一个肝癌特异性的IFNAR-1基因启动子多态性，导致肝癌细胞对干扰素β的反应不同，这与我们的观察结果相呼应，即分泌型LOXL4对肝癌细胞生长的作用微乎其微。尽管可能需要进一步的研究来确认I型IFN信号蛋白的修饰状态，但我们的发现支持这样的说法，即LOXL4对铜依赖的H2O2的产生是I型IFN信号介导的巨噬细胞PD-L1递送的关键激活剂。
对肝硬化和非肝硬化患者LOXL4表达的分析表明，LOXL4在慢性肝炎肝细胞癌患者中高表达。尽管与其他LOXL蛋白相比，有关LOXL4在纤维化中的作用的研究报道较少，但在不同病理因素引起的肝纤维化组织中，LOXL4显著增加，这与我们的观察结果一致。肝纤维化过程中LOXL4诱导的确切机制尚不完全清楚，但促纤维化因子可能启动了LOXL4的转录，肝纤维化过程中高表达的细胞因子转化生长因子β-1通过激活Smad和AP-1转录因子诱导成纤维细胞表达LOXL4，LOXL4的表达与转化生长因子β-1诱导的肝纤维化有关。炎性因子IL-β1在体外可诱导肝纤维化患者肝组织中LOXL44的表达，不同的促纤维化因子及其在肝纤维化形成过程中的相互作用可能共同促进了肝硬化肝组织中LOXL4的表达。
综上所述，我们确定了赖氨酰氧化酶蛋白LOXL4在肝癌发生中的新作用。我们的研究表明，LOXL4在肝癌发生过程中起着促进免疫抑制微环境的重要作用。