科研| Blood：小鼠癌症模型中的代谢物通过芳香烃受体-组织因子增强静脉血栓形成
编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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恶性肿瘤患者发生静脉血栓栓塞症(VTE)的风险要高4-7倍，这是一种潜在致命的但又可预防的并发症。虽然这些患者中血栓形成的一般机制逐渐被了解，但恶性肿瘤特异性的触发因素及其治疗意义仍知之甚少。于是，我们检测了结肠癌特异性的VTE模型，并在下腔静脉(IVC)结扎模型中探索了一组倾向于血栓形成的代谢物。与对照组小鼠相比，注射人结肠癌细胞的裸鼠中IVC血块重量更沉，这是一种静脉血栓形成的生物标志。小鼠血浆代谢组学分析显示，异种移植小鼠血液中犬尿氨酸和硫酸吲哚酚(色氨酸代谢物)水平升高，且与IVC血块大小增加呈正相关。这些代谢物是芳香烃受体(AHR)的配体。因此，异种移植小鼠血浆以AHR依赖的方式激活了静脉内皮细胞内AHR通路，增加了组织因子(TF)和纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1)水平。与此结果相一致的是，异种移植小鼠IVC的内皮细胞显示核内AHR以及TF和PAI-1的表达上调可以激活AHR-TF/PAI-1轴。更重要的是，在异种移植小鼠和注射犬尿氨酸小鼠中，抑制AHR活性可以抑制IVC内皮细胞中TF和PAI-1的表达，并降低了IVC血块重量。总之，这些数据显示了在小鼠癌症模型中色氨酸代谢产物的失调，并且揭示了这些代谢产物与控制癌症中AHR-TF/PAI-1轴和VTE之间的一个新关系。
论文ID
原名：Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor–tissue factor axis
译名：小鼠癌症模型中的代谢物通过芳香烃受体-组织因子增强静脉血栓形成
期刊：Blood
IF：16.562
发表时间：2019.12.26
通讯作者：Vipul C. Chitalia
通讯作者单位：波士顿大学医学中心
实验设计
实验结果
在裸鼠皮下注射结肠癌细胞HT29，建立结肠癌移植瘤模型(图1A)。在注射了HT29细胞的雄鼠和雌鼠体内，移植瘤在注射后的3-4周内迅速生长。4周结束时，肿瘤平均体积为452.66 mm3 (SEM±32.41 mm3) (图1B)。两种性别的肿瘤体积无差异。β-catenin 蛋白是一种对结肠癌生长很重要的致癌标志物，可以鉴定移植瘤中的结肠癌细胞。实验显示β-catenin在结肠癌细胞胞浆和细胞核中均有表达。
在证实了结肠癌移植瘤的生长后，我们接下来检查这些小鼠的血栓形成情况，在接种肿瘤4周后进行IVC结扎(图1A)。这是一个由静脉壁损伤和内皮细胞中TF表达增强而诱发形成的急性完全性静脉血栓模型。结扎48小时后收集血块，对照组由未移植小鼠组成。血块重量作为静脉血栓形成的一个生物标志。我们的结果显示，注射HT29小鼠组的血块重量(20.26±1.31 mg)较对照组小鼠增加80% (11.33±0.05 mg, p=0.001) (图1C)。这些结果证实结肠癌异种移植时增强静脉血栓的形成。然后我们检查了血块重量和肿瘤重量之间的关系。两者之间无相关性，说明在原发肿瘤快速生长之后，除肿瘤体积因素外的其他因素都可能影响静脉血栓的形成(图1D)。
以前的研究已经表明，色氨酸代谢物，如IS和Kyn，在小鼠和人体内都具有血栓形成前的特性。考虑到癌细胞的色氨酸代谢可能被加速，所以利用液相色谱-质谱法(LC/MS) 对这些代谢物进行定量。结果显示，HT29移植瘤小鼠血浆中Kyn水平是对照组的3倍(p<0.001) (图2A)，并且移植瘤小鼠血浆中IS浓度升高了2倍(p=0.03) (图2B)。这些代谢物已被公认可以增加血栓形成，于是我们推测这些代谢物的水平可能与血栓负荷有关。我们的分析显示，Kyn、IS水平与血块重量呈线性相关(图2C-D)，且Pearson R2值为正。虽然这些数据表明Kyn和血栓重量之间的相关性比IS更强，但这暗示了它们在诱发静脉血栓形成方面可能存在潜在的因果关系，这有待进一步探讨。
异种移植小鼠中Kyn的来源可能是内源性和/或由HT29细胞释放。为了确定后一种可能性，我们在培养的HT29细胞中检测Kyn的基础产量和血清诱导的产量。我们推测，Kyn的生成可能会随着培养基中色氨酸的添加或血清(其中包括色氨酸)而增加。为此，将HT29细胞接种于12孔板，血清饥饿，然后在1 mM色氨酸(溶于水)处理下，再用10%血清或不用10%血清分别处理。培养基培养48 h后收集细胞，并用LC/MS进行分析。我们的结果表明，HT29细胞在基础条件下产生Kyn，并在补充血清或色氨酸后显著升高Kyn水平。在无血清条件下，Kyn在培养基中的浓度随色氨酸的添加增加了3倍(28.82±10.96 nM，p=0.014)。与无血清组相比，10%血清组中Kyn水平升高至29.40±13.89 nM (p=0.03) (图2E)。然而，在含10%血清的培养基中补充色氨酸并没有进一步增加Kyn释放。综上所述，这些结果表明，HT29细胞在培养基中产生和分泌Kyn，这与HT29移植瘤小鼠血液中Kyn水平升高的结果一致。
已知这些代谢物在内皮细胞中会通过AHR通路而激活TF活性。我们推测，结肠癌异种移植动物的血浆有可能增强诱发内皮细胞中AHR和TF活性的能力。我们使用静脉内皮细胞进行检测，因为DVT发生在静脉内皮细胞的完整单层细胞上。采用人脐静脉内皮细胞测定AHR活性，因为此细胞稳定表达AHR反应启动子及相连的荧光素酶报告基因。我们使用0.5~2%浓度的小鼠血浆来确定测定AHR活性的最佳浓度(图3A)。用0.5~1%浓度的血浆处理后，AHR活性呈线性增加，而血浆浓度>1%时则无此变化。因此，我们使用1%浓度的血浆进行下一步研究。
异种移植小鼠血浆的AHR活性明显高于对照组小鼠(p=0.007) (图3B)。接下来，将人脐静脉内皮细胞用异种移植小鼠血浆处理，并对细胞中TF活性进行测定。异种移植小鼠血浆诱导TF活性增加了2倍(p=0.019) (图3C)。CH223191是AHR竞争性拮抗剂，可以抑制TF活性的增加(p=0.047)。这些结果说明异种移植小鼠血浆可以激活AHR通路并增强TF活性。
在其他类型的细胞中，PAI-1也受AHR通路的调控。因此，我们检测AHR激活是否增加内皮细胞中PAI-1水平。为此，我们使用不同浓度的Kyn处理内皮细胞，并用AHR拮抗剂CH223191分别处理或不处理细胞。这些细胞的裂解液中PAI-1的表达随Kyn浓度低至0.1 mM而增加了约一倍，然而这种增加完全可以被20 mM 的AHR拮抗剂所逆转(图3D)。
有趣的是，异种移植小鼠血浆中Kyn的浓度(相当于平均浓度，图2A)足以诱导内皮细胞PAI-1表达。同样，用异种移植小鼠血浆处理内皮细胞后，PAI-1表达上调接近2倍(P=0.001)，并且用CH223191处理可以抑制PAI-1的表达(图3E)。然而，与对照组小鼠相比，异种移植小鼠血浆处理细胞对PAI-1的抑制程度更大。这可以用AHR拮抗剂可以抑制异种移植小鼠体内AHR活性增强来解释(图3B)。由于PAI-1可抑制血栓溶解，其在静脉内皮细胞中的上调与异种移植小鼠较高的血栓风险相一致。
图3 异种移植小鼠血浆处理内皮细胞后，AHR活性、TF和PAI-1水平升高。
上述数据表明，在结肠癌异种移植动物中激活AHR可以提高血液的IS和Kyn水平。我们推测AHR信号可能在异种移植小鼠的IVC内皮细胞中被激活，它上调AHR的下游因子，即TF和PAI-1。以AHR的核定位作为AHR激活的证据，将异种移植小鼠4周后的IVC内皮细胞与对照组小鼠的进行比较。在实验中，为了避免手术创伤对内皮细胞蛋白表达的影响，小鼠没有进行静脉结扎(图4A)，用CD31抗体确认其为内皮细胞。对照组小鼠的静脉内皮细胞显示，AHR主要分布于胞浆内；而HT29注射小鼠的静脉内皮细胞显示，AHR定位于细胞核内(图4B)。另外，我们检测了每个实验组的24张IVC图像中相同数量CD31+内皮细胞中核AHR阳性的百分比。在对照组小鼠的静脉血栓形成的内皮细胞中有5.2±1.62%的细胞核AHR呈阳性；而异种移植小鼠中，AHR阳性的内皮细胞比例高出2.5倍(13.17±3.04%; p=0.025)。这些结果显示，在异种移植小鼠的IVC内皮层中，AHR的激活状态增强。
接下来，我们探讨了在IVC未结扎的异种移植小鼠IVC中AHR的下游靶点 (TF和PAI-1)。对照组小鼠中TF表达量最低，与对照组小鼠比较，在异种移植小鼠中TF和PAI-1的表达分别高出4.5倍和2.5倍(图5A-B)。
尽管人类的DVT发生在基本完整的内皮层，但在小鼠的IVC闭塞模型中并非如此，已知该模型会造成严重的血管壁损伤，促使不同细胞类型的TF进入血管壁。因此，我们检测了内皮细胞中以及vSMCs中TF的表达，以CD31标记(图5C)。我们观察到，与主动脉相比，单层的vSMCs在实质上与较薄的IVC壁一致。TF在内皮细胞和vSMCs中明显表达，并且在异种移植小鼠中也均有增加。鉴于内皮层与人类DVT的相关性，我们进一步集中分析内皮层。与对照组小鼠相比，移植瘤小鼠内皮细胞中的TF和PAI-1水平显著升高(图5D-F)。综上所述，这些结果表明，注射HT29小鼠的静脉内皮细胞中有更强的AHR信号激活，从而上调TF和PAI-1的表达。这一发现与在移植瘤小鼠中观察到较高的静脉血栓形成相一致(图1C)。
通过对2个离散小鼠模型的药理学研究，进一步探讨AHR活性在调节癌症相关静脉血栓形成中的作用。由于异种移植小鼠中Kyn水平升高，且Kyn水平与血栓重量相关(图2 C)，这些小鼠血浆诱导内皮细胞AHR、TF和PAI-1水平(图3)，所以我们推测AHR拮抗剂可能会抑制小鼠IVC中Kyn介导的TF和PAI-1的表达，并降低静脉血栓形成。作为对照实验，我们首先检测了无异种移植小鼠中AHR抑制效果。6只裸鼠被静脉结扎后给予CH2213191，持续5天，静脉血栓闭塞后继续注射48小时(图6A)。CH223191处理后，小鼠中IVC血块的重量无明显变化(p=0.112)，表明抑制AHR对对照组小鼠静脉血栓形成无影响(图6B)。竞争性抑制剂的作用也与环境中激动剂配体的水平有关。异种移植小鼠血浆中AHR激动剂Kyn和IS的含量明显升高(图2)。因此，与血液循环中AHR激动剂(Kyn和IS)水平较低的对照组小鼠相比，CH223191可能在异体移植小鼠或注射Kyn小鼠中表现出更强的作用(图2A-B)。
接下来我们研究AHR抑制剂是否抑制Kyn介导的静脉血栓形成。在本实验中，一组8-10周龄的裸鼠被注射Kyn，并分别被注射或不被注射CH223191 (图6C)。未接受Kyn注射的小鼠作为对照组。单因素方差分析显示，三组间血块重量总体差异显著(p=0.02)。与对照组相比，使用t检验进行进一步比较，发现注射了Kyn的小鼠血块重量明显更高(p=0.02)。用AHR拮抗剂处理小鼠后，对照组和Kyn+CH223191注射组的血块重量均降低，且两组间无统计学差异(图6D)。
这些结果充分显示，AHR拮抗剂使Kyn介导的高血栓形成降低至基线，并且注射Kyn小鼠的IVC中TF和PAI-1水平也有所降低(图6D)。与对照组小鼠相比，Kyn显著增加了TF和PAI-1的表达，而两者均可以被CH223191抑制。对照组小鼠和Kyn+CH223191注射组小鼠中TF和PAI-1的表达无统计学差异，表明AHR抑制剂使血管壁内Kyn诱导的TF和PAI-1表达增加趋向正常化。
本实验揭示了Kyn-AHR轴在调节静脉血栓形成中的作用。为了证实AHR抑制剂可以抑制静脉血栓形成的假设，我们进行进一步的功能检测。我们用HT29细胞注射异种移植小鼠(雄性小鼠和雌性小鼠的比例相等)，3周后，将小鼠随机分为2组，第1组每天注射10 mg/kg的CH223191；第2组作为对照组，每天以相同方式注射生理盐水(图7A)。小鼠安乐死后测定肿瘤体积和收取血清样本。两组样本分析结果进行比较，肿瘤体积和Kyn水平无差异(图7B-C)。然而，经CH223191处理后，IVC血块重量减少了4倍(图7D)。
我们又进行了一个平行实验，移植瘤生长4周后收集IVCs，使用免疫荧光法和免疫印迹法检测IVC中TF和PAI-1的表达。为了避免手术创伤对TF和PAI-1表达的影响，这些小鼠未进行IVC结扎。与对照组相比，经CH223191处理的小鼠IVC裂解液中TF和PAI-1水平分别降低了6倍和4倍(图7E-F)。由于IVC裂解液由非内皮细胞类型的蛋白组成，所以我们使用免疫荧光显微镜专门检测IVC内皮细胞中TF和PAI-1的变化。未手术处理的IVCs被固定并染色TF、PAI-1、CD31，这些蛋白被定量 (图8)。与注射HT29组小鼠相比，注射CH223191组小鼠的IVC内皮细胞均明显抑制TF(p=0.005)和PAI-1(p<0.001)。这些数据均表明，在异种移植小鼠内皮细胞中抑制AHR可以抑制TF和PAI-1的表达，并降低IVC血栓块的重量，这说明抑制AHR导致静脉血栓形成率降低。
结论
利用结肠癌特异性DVT模型，目前的研究证实了之前未被发现的某些结肠癌相关代谢物增加并且调控导致癌症相关VTE发生的因素。我们的研究结果表明，结肠癌异种移植动物的血液中Kyn和IS水平升高，并且激活静脉内皮细胞中AHR活性，这一作用导致TF和PAI-1表达上调。TF是一种已知的通过外部凝血级联触发血栓形成的物质，而PAI-1可抑制血栓溶解，二者同时可能增加血栓风险，最终导致DVT，如图9所示。基于我们对癌症相关VTE发病机制的认识，本研究认为AHR-TF/PAI-1轴有可能是造成这种情况的因素。这个轴的节点是可以量化的，并且可以用于癌症患者患有VTE风险的分类，类似于其他疾病模型的分类。AHR和TF都是可治疗的靶蛋白，饮食干预可以调节色氨酸代谢物，所以这进一步证实了可以在血栓形成前逆转血栓发生的潜能。
原文网址：https://ashpublications.org/blood/article-abstract/134/26/2399/422726/Metabolites-in-a-mouse-cancer-model-enhance-venous?redirectedFrom=fulltext