编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
导读
将细胞、线粒体和其他含有多核苷酸的生物颗粒的细胞计数分析与高通量单颗粒测序结合起来，将提供最终的生物分析工具，同时评估大量群体中每个颗粒的表型、功能、基因组和转录组。本研究描述了如何通过适应现有的、成熟的技术来实现这种集成。
原名：Integration of Flow Cytometry and Single Cell Sequencing期刊：Trends in Biotechnology通讯作者：Dmitry S. Andreyev、Boris L. Zybailov通讯作者单位：俄罗斯秋明大学生物X-BIO研究所、美国阿肯色大学医学科学生物化学与分子生物学系
生物学和生物医学研究领域存在着一系列重要问题，这些问题与细胞或其他具有遗传物质的生物颗粒（如线粒体、细胞核和外泌体等）的表型和遗传组成的异质性有关。如：转移性癌症多克隆接种，干细胞致癌预防，微生物组-宿主相互作用，耐药性发展，生物体发育和衰老，神经退行性疾病中的线粒体异质性，致癌性，不育性，遗传性病理等许多研究。而其中数以百万计的小“粒子”必须单独分析，如生物体内的癌细胞或线粒体脂肪细胞。随着测序能力的提高和诸如Drop seq等条形码技术的发展，单细胞基因组和转录体的高通量分析才得以应用。其中，来自每个细胞的多核苷酸被标记为该细胞特有的寡核苷酸“条形码”。为了做到这一点，通过“分裂和池”过程（split-and-pool，从多个单细胞中汇集RNA，将其分裂成相同数量的独立反应，并从中建立文库）制备了许多携带每个细胞特有条形码的“粒子”；这样每个细胞在液滴中与一个条形码粒子配对，然后用“条形码”连接裂解和多核苷酸。通过条形码技术进行单细胞测序后不久，通过CITE-seq和REAP-seq对单细胞同时进行表型和基因组/转录组高通量分析，除了测序数据外，还提供表型分析（仅限于抗体-抗原相互作用）。然而，基于抗体的表型分析仅限于暴露的表位，而流式细胞术和毛细管电泳更为全面，例如，能够洞察膜电位、细胞阶段、大小和形态。这些非破坏性的方法可以为基因型/转录组分析的条形码芯片提供表型特性方面的支持。然而，目前在Drop seq中使用的“分裂和池”条形码合成的随机性阻碍了在表型和序列之间建立一对一的对应关系。实现这种一对一对应的一种可能方法是使用带有独特和已知寡核苷酸条形码的可识别颗粒。与常规条形码不同，由此类非随机条形码，不仅可知一组序列是否源自同一细胞，而且可知它们来自哪个特定的流式分析细胞（图1）。
左图：仪器的框图。流式细胞仪（A）或（B）将具有参考核心（红点）的细胞流（蓝点）提供给液滴生成器（C）。同时，可识别条形码载体（IBC）从串行位置编码芯片提供给相同的液滴生成器，其中IBC识别由序列号（D）进行，或者从具有唯一标识符（ID）的IBC池中进行识别由检测器（E）上的荧光标签组合执行。（A）和（B）：红点以及（D）和（E）：紫点的参考核心用于错误管理。将细胞与IBC配对后（C），像常规的Drop-seq系统中那样监测液滴组成（F）并进行处理/排序。右图：片上仪器实施例的布局示例。电渗泵（通道，电极分别接触并在表面上包含离子化基团（G）来推动和引导细胞通过检测点和分选接合点（H）。将感兴趣的细胞等距存储在细胞累加器（I）中，然后提供给液滴生成器（J）。同时，IBC从芯片（K）或从外部源[即，左面板（E）]提供给液滴生成器。配对检测器（L）之后，像常规的Drop-seq系统一样对单元进行处理/排序。IBC从芯片（K）或从外部来源[即，左面板（E）]提供给液滴生成器。配对检测器（L）之后，像常规的Drop-seq系统一样对单元进行处理/排序。IBC从芯片（K）或从外部来源[即，左面板（E）]提供给液滴生成器。配对检测器（L）之后，像常规的Drop-seq系统一样对单元进行处理/排序。首先，需要一种用于识别载体的方法。可以通过连续流出中的序列号（图1D）或通过唯一的，在流中可检测的核心（图1 E）来标识它。第二，还需要一种对每个载体具有唯一已知序列的寡核苷酸合成方法。可识别的条形码载体（IBCs）由连续流出的核心中的序列号识别，可使用磁性、流体力学和介电电泳方法可逆地固定在芯片表面的微流控通道中的预定点处。磁性固定可以说是最简单的方法（图2，上图），而其他方法可以提供逐个的控制释放。具有预定的、独特序列的寡核苷酸可以在芯片的每个含有核的点上合成，如光刻“基因芯片”制造中使用的那样（图2，上图）。当需要时，IBCs可以从芯片表面释放到微流控通道中，并连续洗脱到液滴发生器（图1C）。
上图：带磁固定的可识别条码载体（IBC）芯片的处理，侧视图。在微流控通道（黄色）的指定位置，通过外部电场（1和2）固定带有表面锚定物的光解基团（绿色）的磁珠。带有曲流通道的芯片（即图1D，J）作为常规的“基因芯片”进行处理：（3）通过数字光处理（DLP）进行点选择性光学去保护，（4）将核苷酸与另一个可光降解保护基连接，（5和6）重复，直到完成所有所需的寡核苷酸。处理过的芯片可以存储在同一个场中，直到使用，当（7）磁铁被移除，IBC被连续地供应给仪器。下图：使用流动可检测标识符（ID）处理IBC核心。（A）ID生成：核心由荧光标签组合标记。（B）重复移除：所有具有相同ID（标签组合）但只有一个的核心，使用细胞分选机（例如，荧光激活分选，FACS）移除。（c）通过跟踪混合合成产生的ID特定条形码：从混合器的内核被随机地定向到四个腔室中的一个，其中A、T、G或C核苷酸被添加到它们中，并且流动检测器记录每个给定核心中添加的核苷酸。然后，核心返回混频器，循环重复。当IBC随后通过流动检测器进入仪器时，产生的IBC与相应的ID条形码链接数据库的混合物可以一直保存到使用。对于内部标识符（ID），可以是光学（包括荧光）标签、磁性或射频识别（RFID）核心。商业细胞计数珠阵列包含两个浓度为十个浓度的荧光团，给出
210=1024个ID，这可能不足以进行高通量分析。但是，将荧光团的数量增加到四个将提供410=1048576个ID。八个荧光团将提供10737418824个ID。在“分裂和池”合成中使用更多的荧光团，可用于IBC的ID数量大幅度增加（图2A）意味着使用具有组合荧光ID的IBC的仪器的通量只受排序能力的限制，而不受ID数量的限制。基于荧光的IDs需要一个具有匹配通道数的细胞型检测器。商业上可买到适合这项任务的细胞仪和适应的软件。
在准备足够数量的具有不同ID的核心之后（删除具有相同ID的重复项）。任何带有合适软件（图2B）的细胞分选仪器都可用于读取每个通道中的核心荧光，将强度与数据阵列中先前核心的值进行比较，如果已经看到该ID，则对重复核心进行分选，或者记录数据，如果该ID是新的，则对核心进行采集，并重复该过程，直到对所有核心进行排序或完成ID数据数组。具有一组具有唯一ID的核心，必须在每个核心上创建相应的唯一寡核苷酸条形码。在执行此操作的可能方法中，研究人员建议将跟踪混合合成作为一种最佳方法（图2 C）。由于相对简单，它没有为给定的ID预先定义序列，但是在合成后每个ID的唯一序列都是已知的。带有免费数据库的一组IBC（定义每个核心ID和条形码序列之间的链接）可通过流式检测器提供给液滴生成器。大多数细胞仪可以直接向条形码芯片（图1C）提供细胞，但代价是IBC过度使用，因为流出的细胞被鞘液稀释，太多的IBC液滴将不包含细胞。柱上检测（图1B，H）或用细胞蓄积器增强细胞仪（图1A，I）可以解决稀释问题，减少IBC的过度使用。场驱动系统（电渗系统）带有反馈回路，可以按需供应电池，通过在每个液滴中放置一个电池和一个IBC来消除IBC的浪费。基于液滴的分选器需要连续，有序地收集液滴，并且将从细胞累加器（图 1A）中受益，以减轻相关的稀释和顺序错误。相比之下，具有柱上检测功能的流式分选器（图1B，H）没有这些限制。将条形码序列的数据库与细胞计数数据链接起来很容易出错。在产生IBC的芯片中，用于寡核苷酸合成点可能是空的或被多个核心占据。在细胞/ IBC配对液滴中，一对一的比率可能会受到影响。在流式细胞仪中，单个事件可能会检测到多个细胞，或者细胞可能粘连或切换洗脱顺序。这些错误将以条形码数据库和细胞数据中索引不匹配的形式表现出来。可以采用两种可能的校正方法予以纠正。为了进行预序列校正，可以将荧光标记的参考核心添加到通过序列号标识的IBC中（但不添加具有固有ID的IBC），并添加到分析的细胞中。产生IBC的芯片和细胞累加器的图像（图1 A，D）将揭示这些参考IBC在正常细胞和IBC之间的洗脱顺序（分别为图1 A，D；红色和紫色点）。这些数据将与流量检测器的数据进行比较（图1 A，B，E，F）。为了进行测序后校正，将配对的参考IBC的已知条形码序列（一个来自细胞样品，另一个来自IBC供应）与配对数据（图1 F）和光学分析预期的洗脱顺序进行比较（图1 A，B， E）。合并使用这些方法将揭示IBC和细胞是否按照洗脱顺序交换位置或丢失，并揭示垃圾粒子读取和配对不匹配。对于已确认的交换位置，将修复受损数据。或者，如果校正数据不能修复，则将消除参考IBC之间的单元的受损数据（图1A、B；红点之间的蓝点）。研究者预计，基于in-drop条形码的单细胞测序技术将随着on-flow检测方法的全面应用而得到发展。如流式细胞术（一种转化性分析工具）用于全面评估细胞、细胞器、外泌体和其他生物实体的遗传组成和表型特性的异质性。
