综述 | circRNAs和外泌体：人类肿瘤的神秘领域（国人作品）
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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外泌体是一种纳米级的膜结合囊泡，含有大量活性物质（DNA、非编码RNA、蛋白质等），为细胞间传递效应信息提供了一种新的方法。环状RNA（circRNAs）是一种ncRNA，近10年来随着全基因组和转录组测序技术的发展，越来越受到人们的关注。越来越清楚的是，circRNAs通过各种行为来调控基因表达，并在人类癌症生物学的许多领域发挥着不同的作用。值得注意的是，有研究报道外泌体中富含circRNAs，并且外泌体circRNAs在肿瘤生物学中发挥着重要作用。外泌体circRNA可被邻近或远处的细胞所摄取，并影响受体细胞生理和病理状态的许多方面，可能促进细胞通讯和肿瘤转移。在此，研究者简要回顾了circRNAs的分子机制和外泌体circRNAs的最新发现，并强调了外泌体circRNAs在人类癌症中的特殊作用。
论文ID
原名：circRNAs and Exosomes: A Mysterious Frontier for Human Cancer
译名：circRNAs和外泌体：人类肿瘤的神秘领域
期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids
IF：5.9
发表时间：2019年11月28日
通讯作者：卢凯华、徐永灿、Ming Sun
作者单位：南京医科大学第一附属医院，浙江大学医学院湖州医院，美国德州大学MD安德森癌症中心
主要内容
外泌体是指由各种细胞分泌到细胞间隙和体液中的纳米磷脂双层结合囊泡。外泌体的直径从30到100纳米不等，并显示一些特定的表面分子标记，如CD9、CD63和CD81。外泌体于1983年被研究人员发现，随后被命名。随后的研究表明外泌体的形成有四个阶段：起始、内吞、多泡体（MVB）形成和外泌体分泌。在这一过程中，ESCRT复合物和相关蛋白在外泌体的生物发生和物质货物分选中起着关键作用。该复合物可以提取泛素标记的蛋白质，引导其进入微血管，并通过类似胞质分裂和病毒出芽的过程与外周膜分离。释放后，外泌体存在于细胞间隙中或在生物流体中循环。通过靶细胞膜融合，这些囊泡可被邻近细胞或远端受体细胞内化，从而改变靶细胞的行为。近年来，越来越多的数据开始提出外泌体不仅是细胞的“垃圾箱”，而且是不同细胞间相互作用的重要介质的观点。事实上，最近有报道称，外泌体包裹着多种生物活性物质，包括脂类、常见的或特异的蛋白质、DNA片段和RNA分子（mRNA和ncRNA）。因此，尽管效应信息在不同细胞间传递，外泌体提供了一种新的细胞间通讯方式，并参与多种生理和病理过程，如血管生成、免疫反应、抗原提呈、细胞分化、肿瘤细胞迁移和侵袭。有趣的是，研究人员发现肿瘤细胞分泌的外泌体比正常细胞多约10倍，癌细胞对外泌体的特性有准确的靶向机制，这表明外泌体在肿瘤形成和发展中起着至关重要的作用。
一些文献已综述了外泌体microRNAs（miRNAs）和lncRNAs（long ncRNAs）在肿瘤生物学中的多效性作用。除microRNAs和lncRNAs外，在外体中也发现了circRNAs，其在人类癌症中的重要作用不容忽视。因此，在下面的章节中，本文简要地概述了circRNAs的分子机制，重点介绍了近年来肿瘤外泌体circRNA的研究进展，以及外泌体circRNA在肿瘤生物学功能和临床意义方面的研究现状。
近几十年来，不断更新的新技术的广泛应用促进了RNA领域的全面发展。来自新一代测序的证据表明，基因组的非编码部分（如lncRNAs）可能参与调节机体的复杂性。在复杂的ncRNAs景观中，circRNAs引起了越来越多的关注，引起了人们对其生物学和功能的高度关注。
1976年，电子显微镜首次在RNA病毒中鉴定出circRNAs。然而，由于circRNAs的低丰度和结构特异性，在接下来的几十年里，它们曾被认为是生物体中的“剪接噪声”或“暗物质”。因此，只有极少数的环状RNA（如ANRIL）被报道为具有很少功能的RNA。近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，circRNAs已成为研究热点。
circRNAs是一种新型的RNA分子，通常是由前体mRNA（pre-mRNA）背接过程产生的单链环状分子，在这个过程中上游受体位点与供体位点连接。绝大多数circRNAs来自已知的蛋白质编码基因，包含一个或多个外显子。根据包含的结构，这些RNA分子被分为四类：外显子环RNA（ecRNAs）、内含子环RNA（ciRNAs）、外显子-内含子环RNA（eIciRNAs）和基因间环RNA。与线性RNA不同，circRNAs由于其特殊的结构而具有一定的性质。由于缺少poly（A）尾，circRNAs是稳定的，对外切酶（包括RNaseR）具有抗性。circRNAs的中位半衰期是其对应的线性基因的2.5倍。此外，一些circRNAs在组织、细胞、发育和年龄方面的表达具有严格的特异性，这支持了其具有重要功能的假设。事实上，最近许多研究揭示了circRNAs与人类疾病的关系，包括神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病视网膜病变和肿瘤。因此，人们对circRNA在人类疾病中的功能和分子机制的理解正在不断扩展。
图1：环状rna的细胞分子机制的范例
circRNA作为miRNA海绵：circRNAs的区别功能是它的miRNA诱饵能力。迄今为止，越来越多的证据表明，许多circRNA通过充当miRNA海绵分子来调节基因表达（图1F）。与其他竞争性内源性RNA（如lncRNA或假基因）相比，circRNAs表现出更强的结合miRNAs的偏好，被称为“超级海绵”。最好的例子也许是ciRS-7（miR-7的circRNA海绵），CIRS7，也被称为CDR1as，长度约为1.5 kb，包含超过70个保守的miR-7结合位点。大多数结合位点与由Ago2蛋白和miR-7组成的RNA诱导沉默复合物（RISC）结合。此外，研究已经证实，由miR-7过度表达或敲除CIRS-7引起的表型相似，表明CIRS7可能通过miR-7/CIRS-7轴在病理生理过程中发挥重要作用。类似地，circ-SRY是一种源于性别决定区Y（SRY）的环状RNA，其功能与CDR1as相似。它包含16个miR-138结合位点，并通过吸附miR-138调节miR-138靶基因的表达。另外，一些circRNAs由多种miRNA反应元件（MREs）组成。例如，Li等人发现circ-ITCH具有吸附miR-7、miR-17和miR-214的功能。在人类癌症中，circHIPK3通过吸附多种miRNAs（9个miRNAs，18个结合位点）来作为一个调节因子调节细胞生长。
然而，值得注意的是，尽管CeRNA的机制类似于circRNA的经典功能，但围绕circRNA的争论是不可避免的。Militello等人进行了一项调查，以验证circRNAs作为miRNA海绵的功能，并在已公布的数据和数据库中进行了筛选。不幸的是，数据证明，不同类型的环状RNA不能作为“真正的”miRNA海绵。因此，还需要进一步的研究来阐明circRNAs、miRNAs和mRNAs的网络。
circRNA与蛋白质的相互作用：除了circRNA对miRNAs的影响外，circRNA的另一个新功能是与蛋白质的相互作用（图1C）。它能通过结合位点吸附一种或某些蛋白质，从而调节基因表达，起到蛋白海绵的作用。circRNA蛋白诱饵的最佳实验支持示例是circMBL。在circMBL序列中存在功能性MBL结合位点的情况下，MBL蛋白可以与circMBL更有力且特异性地结合，这对circRNA的生物发生是必不可少的。因此，circMBL通过分离多余的MBL蛋白在平衡MBL mRNA和circMBL表达水平方面起着关键作用。此外，circPABPN1也可以调节PABPN1蛋白的表达水平。高水平的circPABPN1阻止HuR与PABPN1 mRNA结合并抑制PABPN1翻译。此外，另一个有趣的例子是circ-Foxo3，它由Foxo3基因编码，作为肿瘤抑制因子。Du等人报道circ-Foxo3异位表达通过形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元配合物抑制细胞周期中G1期的进展。除p21和CDK2外，circ-Foxo3还与ID-1、E2F1、FAK和HIF1相互作用，这些蛋白在细胞质中，导致其抗衰老和抗应激能力丧失，增加细胞衰老。
cirRNA调节基因转录：与circRNA的上述重要作用相比，circRNA在转录调控中的作用还没有广泛的研究。最近，一些circRNAs在细胞核中大量存在，它们可能干扰转录，例如eIciRNAs和ciRNAs（图1A和1B）。研究人员发现，当circEIF3J和circPAIP2基因敲除时，EIF3J和PAIP2基因的转录效率分别显著降低。尤其是这两个eIciRNAs与小核核糖核蛋白（U1 snRNP）结合，促进RNA聚合酶II与亲本基因启动子区的相互作用，导致基因的转录增加。此外，某些ciRNAs，如ci-ankrd52和ci-sirt7，在其亲本基因转录位点积累并与RNA聚合酶II相互作用形成正反馈调节。有趣的是，eIciRNAs和ciRNAs不仅存在于它们的转录区域，而且还聚集在染色质的其他部位，这表明它们可能在转录过程中调节基因表达。综上所述，这些发现表明内含子衍生的circRNA在细胞核中起着转录调节作用。
circRNA能被翻译成蛋白质：考虑到缺乏poly（A）尾和5’ 7-甲基鸟苷帽子结构，大多数研究者认为circRNAs代表内源性ncRNAs的一个独特类别。大多数研究者认为circRNAs代表内源性ncRNAs的一个独特类别。然而，令人信服的证据表明，circRNAs可以作为蛋白质合成的模板，类似于线性mRNAs（图1D）。早在1986年，Kos等人识别出第一个能翻译为蛋白质的环状RNA。它是一种单链环状RNA，从δ型肝炎病毒基因组转录而来，产生122个氨基酸。此外，一些报道表明，利用起始密码子ATG或内部核糖体进入位点（IRES）进行基因工程，circRNAs在体内和体外都可以翻译。例如，circ-ZNF609包含753nt开放阅读框（ORF），并以剪接依赖和帽子独立的方式编码蛋白质。此外，Zhang等人证明了circ-SHPRH、circ-FBXW7及其编码的蛋白质在正常人脑中大量表达，而在胶质瘤中表达减少。以上研究均提示内源性circRNAs可能产生蛋白质，为circRNAs的研究提供了新的方向。
近年来，越来越多的证据表明:富含ncRNA的外泌体参与了肿瘤的多种生物学过程，尤其是恶性肿瘤的转移。Li等人首先报道了外泌体中存在丰富的circRNA。他们通过全基因组RNA测序（RNA-seq）分析鉴定了MHCC-LM3肝癌细胞和细胞来源的外泌体的circRNA转录本。结果表明，外泌体circRNAs在外泌体中的浓度比亲本细胞至少高2倍，为研究circRNAs提供了新的途径。考虑到外泌体中的circRNA种类与多种细胞类型的不同，随后研究者研究了circRNA的分类机制。整合到外泌体中的circRNA是选择性的，基于过表达分析，Li等人发现circRNAs进入外泌体的过程至少部分是通过调节亲代细胞中相关的miRNA水平来控制的。另外，其他可能的机制包括RNA相关蛋白与circRNAs结合。实际上，在另一项研究中，Dou等人鉴定了KRAS突变体（DKO-1）、突变体/野生型（DLD-1）和野生型（DKs-8）细胞和外泌体的circRNA表达谱。根据Li和Dou等人的研究结果，发现外泌体中的circRNA水平远高于细胞中的水平。更重要的是，作者比较了突变型和野生型KRAS来源的外泌体中两个结肠癌相关的circRNA及其相应的线性mRNA的表达水平。令人惊讶的是，两个circRNA水平的变化与它们的线性mRNA宿主基因的变化并不一致。结合蛋白质组学分析结果，特异性的外泌体定位、富集的RNA结合蛋白可能是circRNA和线性RNA的相对差异的原因。尽管如此，circRNA相关的确切机制仍不清楚。
尽管外泌体circRNA的生物学功能尚未完全阐明，但近年来越来越多的研究集中在外泌体circRNA上。新的研究表明，来源于肿瘤细胞或其他细胞（如活化的人血小板和脂肪细胞）的外泌体circRNA可以将生物信息传递给特定细胞，从而实现表型变化的有效传递，从而促进癌症的发生（图1E）。
circ-IARS：circ-IARS是一种新的参与胰腺癌过程的circRNA。Li和他的同事发现胰腺癌中circ-IARS表达上调，circ-IARS表达水平与肿瘤转移呈正相关，与术后生存时间呈负相关。还应指出，胰腺癌是一种胃肠道肿瘤，具有较强的转移能力和较高的死亡率。作为屏障的内皮细胞的功能是控制周围组织和血液之间交换和防止胰腺癌细胞侵袭的重要因素。因此，维持这种功能可能是抑制肿瘤侵袭和转移的一种好方法。先前的研究报道RhoA表达和活性在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增加能够上调F-actin水平，降低紧密连接蛋白ZO-1的表达，导致细胞内收缩力增加，内皮屏障功能损伤，内皮细胞单层通透性增强。Li等人发现circ-IARS通过外泌体从胰腺癌细胞转移到血管内皮细胞，通过miR-122的吸收和RhoA信号的激活调节内皮细胞通透性的变化，这提示外泌体是癌细胞内皮细胞通讯的关键因素。
circRNA_100284：另一个参与致癌的外泌体circRNA是circRNA_100284，它在长期暴露于亚砷酸盐的肝细胞中表现出较高的水平。Dai等人发现亚砷酸盐可诱导正常肝细胞恶性转化，并伴有circRNA_100284的过表达。为了研究circRNA_100284对亚砷酸盐相关肿瘤的影响，随后进行了基因敲除和过表达分析。结果表明，circRNA_促进了亚砷酸盐转化细胞的克隆形成、侵袭和迁移。令人惊讶的是，亚砷酸盐转化细胞与参与癌症发展的邻近细胞相互作用。转化后的肝细胞培养基中circRNA_100284上调，促进了正常肝细胞的增殖，加速了正常肝细胞的细胞周期。用电子显微镜，Dai等人发现携带circRNA_100284的外泌体从恶性细胞转移到非恶性细胞。非恶性细胞摄取外泌体，circRNA_100284通过充当miRNA-217的海绵增加EZH2和cyclin-D1的表达，导致非恶性细胞向恶性转化。
circ-PDE8A：胰腺导管腺癌（PDAC）是人类最常见的恶性肿瘤。高死亡率部分归因于肿瘤的转移潜能和高复发风险。为了探讨PDAC进展和转移的分子机制，Li等人应用基因芯片技术鉴定了肝转移PDAC细胞外泌体circRNA表达谱。结合qRT-PCR结果，他们发现包括circ-PDE8A在内的3个circRNA在Hs766T-L2细胞（来自Hs 766T肝转移组织的第二代原代细胞）外泌体中有明显的高表达。circ-PDE8A作为miR-338的ceRNA，调节MACC1和MACC/MET/ERK或AKT通路，导致侵袭性增加。荧光显微镜分析显示PDAC细胞中确实存在外泌体通讯。此外，血浆外泌体circ-PDE8A的高表达是整体生存的独立风险。
ciRS-133：癌症相关恶病质，一种代谢综合征，是癌症生存的消极风险因素。与健康个体相比，恶病质的定义特征是过度的能量消耗。然而，对于癌相关恶病质的分子机制知之甚少。Zhang等人鉴定了恶病质相关的血清外泌体circRNA（ciRS-133）。他们发现在胃癌组织和胃癌患者血浆中ciRS-133的表达增加。进一步分析发现，ciRS-133与胃癌患者棕色脂肪组织的质量和体脂率呈正相关。胃癌细胞来源的外泌体将ciRS-133传递到前脂肪细胞。在前脂肪细胞中，ciRS-133通过miR-133海绵作用促进PRDM16的表达，促进前脂肪细胞向棕色细胞分化。在动物模型中，ciRS-133抑制基本阻止棕色脂肪组织褐变并产生肿瘤相关恶病质。
circPTGR1：尽管新的证据已经揭示了外泌体circRNA在细胞间通讯中的作用，但对具有不同转移潜能的癌细胞系之间的相互作用仍知之甚少。Wang等人比较了不同转移潜能的肝细胞癌（HCC）中外泌体circRNA的差异。结果显示，在转移性肝癌细胞中，circPTGR1的三个亚型上调。令人惊讶的是，通过与miR449a的种子序列竞争，敲除circPTGR1基因可以抑制LM3细胞的转移，促进MET的表达。然而，PTGR1基因的敲除并不影响肝癌细胞的转移。更重要的是，肝癌细胞转移潜能的增加，可以通过携带circPTGR1的外泌体将这种潜能赋予低转移能力或无转移能力的细胞，从而促进肝癌细胞的转移能力和进程。尤其是，由于circPTGR1在HCC患者血清外泌体中含量丰富，且与临床分期和预后密切相关，它可作为HCC的治疗靶点和预后标志物。
circ-DB：除了癌细胞来源的外泌体circRNA外，一些研究还着重于其他细胞分泌的外泌体circRNA的作用。最近发表在《Nature》杂志上的一篇文章指出，脂肪来源的外泌体可以调节其他组织中的基因表达，这表明外泌体可能是介导脂肪细胞和靶器官之间信号传导的重要载体。Circ-DB（Has_circ_0025129）是一种脂肪分泌的外泌体circRNA，在体脂比较高的肝癌患者中上调。circ-DB是从位于12号染色体上的TNFRSF1A（TNFR1）转录而来。鉴于外泌体circ-DB与miR-34a表达水平呈负相关，而miR-34a表达水平与肝癌患者的USP7呈负相关，研究人员随后探讨了外泌体circ-DB、miR-34a和USP7的潜在分子机制。结果表明，脂肪来源的外泌体是外泌体circ-DB的载体，通过在体内外吸附miR-34a并激活USP7/CyclinA2通路，促进肝癌生长并抑制DNA损伤。有趣的是，先前的一项研究表明，USP7对核因子kB（NF-kB）的去泛素化是TNFR诱导基因表达的必要条件。因此，USP7和circ-DB的表达是否是正反馈调节有待于进一步研究。
许多癌症病人到了晚期才被诊断出来，部分是由于缺乏精确的生物标记物。一般常规指标，如CEA、AFP和CA125，在早期可能在正常范围内。因此，寻找敏感、特异的生物标志物，对肿瘤的早期发现和治疗，特别是高危患者的早期发现和治疗具有重要意义。恶性肿瘤的无创早期诊断是肿瘤研究中的一个长期热点，而液体活检是解决这一重要问题的一个非常有吸引力的方法。大多数的研究都集中在作为诊断生物标志物的外泌体lncRNA和miRNAs上。由于其特殊的环状结构，circRNAs在体液中比线性RNAs更稳定。血清外泌体circRNAs似乎是一种更有前途的无创性肿瘤生物标志物。在此，研究者总结了人类肿瘤外泌体circRNA的临床意义。
最近，一项研究报道了从子宫内膜癌患者血清中分离的细胞外囊泡（EVs）中的circRNA图谱。在这些患者当中，共检测到275个差异表达的circRNAs，其中上调209个，下调66个。通过KEGG分析，研究者发现275个差异表达的circRNA中有12个富集在5个途径中（focal adhesion黏着斑通路、肌动蛋白细胞骨架调控、细胞外基质[ECM]-受体相互作用、Amoebiasis通路和致心律失常的右室心肌病）。另外，另一项研究采用高通量测序技术分析甲状腺乳头状癌患者血清外泌体circRNA的表达变化，结果表明，共有22个circRNAs差异表达，其中3个circRNAs上调，19个circRNAs下调。通过GO聚类分析，发现这些差异表达的circRNAs与16条信号通路相关。此外，qRT-PCR技术证实这些外泌体circRNA的生物学功能和分子机制有待于进一步研究。
Chen等人报道了肿瘤释放的外泌体环状RNA-PRMT5在UCB患者尿和血清外泌体中均高表达。此外，血清或尿外泌体中circPRMT5的表达水平与淋巴结转移和晚期肿瘤进展呈正相关，提示circPRMT5是一种有前途的UCB患者预后标志物。进一步的体外分析表明，通过circPRMT5/miR-30c/SNAIL1/E-cadherin途径，circPRMT5加速了肿瘤细胞的EMT过程，并导致形成侵袭性表型。此外，从喉鳞状细胞癌（LSCC）患者提取的血清外泌体中发现circRASSF2水平升高。进一步分析显示：LSCC患者血清外泌体中circRASSF2表达水平与miR-302b-3p呈显著负相关。遗憾的是，这两篇文章的作者并没有计算出特定circRNAs的敏感性和特异性。
除了在细胞间通讯中已确定的外泌体circRNA的作用外，不需要的细胞circRNA清除是细胞外囊泡（包括外体和微泡）的另一个作用。虽然人们对circRNA的表达水平和生物发生有相当多的关注，但对其在正常细胞和肿瘤细胞内的代谢却知之甚少。由于circRNAs缺乏5’和3’端，它们对主要的mRNA降解酶具有抗性，并且比线性RNAs更稳定，从而导致circRNA的积累。目前尚不清楚这种积累是否具有毒性。Lasda和Parker报道了一种细胞处理circRNAs的机制。他们发现细胞可以通过胞外小泡将circRNAs清除到胞外空间。尽管如此，这些结论还是相对较新的，需要进一步的研究来验证细胞外空间中circRNA的降解过程。
结论
RNA领域的不断发展表明，circRNAs在生理和病理过程中发挥着重要作用。作为纳米级的生物囊泡，外泌体携带特殊的蛋白质和RNA分子，作为细胞间交换信息的新方式，从而促进细胞间的通信。近年来，外泌体RNAs一直是外泌体研究的热点。因此，在这篇综述中，研究者着重讲述了circRNAs的多种机制，并报道了关于外泌体circRNAs在人类癌症发展中的作用及其临床意义的研究现状。利用外体circRNAs的稳定性和高度特异性，这些分子可能是癌症早期发现、对癌症患者进行最合适的治疗和可能有监测疾病进展或复发的潜力的一个有希望的癌症标志物。而且，为了成功地开发出治疗癌症的渐进性治疗方法，特别是精准的药物，不应忽视外泌体circRNA可以作为一种选择，因为外泌体具有良好的生物分布和生物相容性。尽管如此，与外泌体lncRNA和miRNA相比，目前对circRNAs与外泌体之间的认识仍存在许多空白，例如，外泌体circRNAs在体液中运动的机制以及外泌体circRNAs在肺癌中的作用。一旦完全阐明与人类癌症相关的外泌体circRNA功能和分子机制，将开辟新的思路，为恶性肿瘤的治疗提供新的途径。
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