科研 | Developmental Cell：单细胞分辨率下的人类呼吸道的体外和体内发育

编译：不二，编辑：十九、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

芽尖祖细胞可产生所有小鼠肺上皮细胞系，并已在发育中的人类肺中进行了研究。但是，控制人类芽尖分化为特定细胞谱系的机制尚不清楚。本研究使用人类芽尖类器官培养物，鉴定出SMAD信号是芽尖转变为呼吸道的关键信号。SMAD诱导具有克隆增殖和多细胞谱系分化的功能性基底细胞的呼吸道类器官的分化。为了对体外来源的类器官进行研究，作者对11.5到21周发育过程中的人类肺部单细胞mRNA图谱进行了测序，该图谱揭示了体外和体内呼吸道间的高度相似性。这项工作阐明了体外人类呼吸道的分化，并提供了正在发育的人类肺的单细胞图谱。

论文ID

原名：In Vitro and In Vivo Development of the Human Airway at Single-Cell Resolution

译名：单细胞分辨率下的人类呼吸道的体外和体内发育

期刊：Developmental Cell

IF：9.19

发表时间：2020.02

通讯作者：Barbara Treutlein，J. Gray Camp和Jason R. Spence

通讯作者单位：美国密歇根大学医学院

DOI号：10.1016/j.devcel.2020.01.033

结果

SMAD激活诱导芽尖祖细胞类器官体外TP63表达

小鼠中已报道的谱系追踪表明，TP63⁺细胞是小鼠中的Sox9⁺祖细胞分化的。虽然TP63是成熟基底细胞的标记基因，但使用Tp63-cre^ER的小鼠中的谱系追踪显示，在胚胎10.5天（E10.5）之前，Cre会激活整个肺上皮的标记以及TP63⁺细胞的标记，而对于成熟的基底细胞标记基因KRT5为阴性，表明E10.5之前的早期TP63⁺/KRT5^-细胞是多能祖细胞，而不是真正的基底细胞。这些数据表明，小鼠气管上皮的基底细胞在早期发育过程中已模式化。随着肺的发育和呼吸道的延伸，芽尖祖细胞在支气管的尖端自我更新，而留下的细胞将形成肺内呼吸道（图1A）。然而，人类和小鼠在整个支气管中基底细胞的分布存在差异，除了最小的细支气管，人类支气管中所有细胞都含有基底细胞。基底细胞在整个人类肺内呼吸道中的延伸表明，芽尖祖细胞分化为所有呼吸道细胞谱系，包括呼吸道基底细胞，并且在人类发育过程中拥有很长时间的窗口期。

为了了解人类芽尖祖细胞分化为不同呼吸道细胞谱系的能力，作者利用了人类胚胎芽尖祖细胞的类器官培养物。在含有“3细胞因子”（3F培养基）、FGF7、小分子CHIR-99021和全反式维甲酸（ATRA）的培养基中分离和扩增芽尖祖细胞，单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，体外维持的人类胚胎芽尖类器官祖细胞为同质细胞群（图1B）。通过降维和tSNE将细胞群可视化，芽尖类器官祖细胞表现出低细胞异质性，并表达了人类芽尖祖细胞标记基因，包括SFTPC、ID2和HMGA1（图1C）。

检测了3种已知对肺发育重要的信号通路激活剂和抑制剂在3天后诱导芽尖类器官祖细胞中TP63基因表达的能力（图1D）。在3F培养基中生长的芽尖类器官祖细胞表达的TP63低。许多实验组显示出TP63表达适度增加，与DMSO对照中观察到的水平相当，表明这些实验组中的表达可能是由于去除3F培养基后发生的随机分化所致。TGFβ-1处理是显著诱导TP63 mRNA表达的条件（图1D）。为了检测SMAD信号的抑制是否可以在允许的环境中阻断TP63表达，作者用3F培养基及仅FGF7的培养基培养了芽尖类器官祖细胞10天，随后去除CHIR99021和ATRA后显示出适度的TP63表达，与DMSO对照或者FGF7加SMAD抑制剂A8301和NOGGIN的培养基培养3天相似（图1E）。我们在对照组中加入了FGF7，来维持类器官生存，因为单在DMSO条件下会很差。相对于3F培养基，仅FGF7组具有更高的TP63表达。但是，SMAD抑制剂的加入阻断了TP63的诱导，这表明SMAD信号的激活在这种情况下对于TP63表达很重要。

SMAD激活诱导TP63表达的结果是出乎意料的，因为其他研究表明在体外维持成熟的成年基底干细胞需要抑制SMAD。后续的筛选实验，我们测试了处理3天后，多种SMAD激活剂和抑制剂单独或组合使用后调节芽尖类器官祖细胞中TP63表达的能力（图1F）。与先前的发现一致，TGFβ-1诱导了TP63（图1D）。但是，TGFβ-1加BMP4（双重SMAD激活，DSA）显示TP63表达显著增加（图1F）。相反，与对照相比，双重SMAD抑制（DSI）对TP63没有影响（图1F）。DSA处理3天导致KRT5和KRT14的增加不显著，但其他肺上皮细胞类型的标记基因却没有增加（图1G）。蛋白染色显示，DSA处理的芽尖类器官在3天后5802个DAPI⁺细胞中的3535个细胞（60.13％）表达TP63，而对照中的3094个DAPI⁺细胞中只有5个（0.0016％）（图1H和1I）。处理3天后，TP63⁺中不存在成熟基底细胞标记物KRT5的蛋白表达（图1H）。DSA处理导致更密集的上皮结构（图1H），KI67染色测得的增殖明显减少。在存在和不存在CHIR99021的情况下，DSA都会显著增加TP63的表达。与芽尖类器官祖细胞实验一致，用DSA处理整个远端肺组织（妊娠2、10和11周）导致TP63蛋白和mRNA表达显著增加，DSA在多种情况下都是TP63的有效诱导剂。

图1 SMAD激活诱导芽尖类器官祖细胞TP63表达

发育中的人类胚胎呼吸道和气管的SMAD核定位

鉴于SMAD激活诱导了芽尖类器官祖细胞中TP63的表达，作者试图通过检查12周和17周胚胎肺中的核pSMAD免疫荧光和TP63表达来研究体内SMAD信号的状态。在12周的胚胎肺中，我们发现芽尖祖细胞中的pSMAD染色较弱（图2A），而在非软骨和小软骨呼吸道中的TP63⁺细胞中观察到了清晰的pSMAD核染色（pSMAD2-图2A）。有趣的是，在气管TP63⁺细胞中，核pSMAD2和pSMAD1，5，8染色较弱（图2A）。胚胎17周肺中的TP63⁺细胞缺乏较强的核pSMAD染色，与解剖位置无关。与已报道的在成年气管中的研究一致，成熟的基底细胞中核pSMAD较低或检测不到，胚胎气管中的TP63⁺细胞pSMAD染色几乎检测不到，而腔TP63^-气管上皮细胞显示出强烈的pSMAD免疫荧光（图2A）。

作者在第12周和第17周检测了整个呼吸道中的TP63⁺细胞，以确定它们是否与成熟基底细胞相关的KRT5共表达（图2B）。妊娠12周时，气管和支气管中的TP63⁺细胞与KRT5共表达。在软骨呼吸道中，大多数TP63⁺细胞是KRT5^-；然而，TP63和KRT5⁺细胞在呼吸道内的不同细胞簇中可见（图2B）。在非软骨气管和细支气管远端，TP63⁺细胞为KRT5^-（图2B）。在妊娠10至20周的整个发育过程中，整个呼吸道中TP63⁺细胞分布的定量分析显示，较小呼吸道中的TP63⁺细胞随时间下降，气管TP63⁺细胞的数量几乎没有变化（图2C）。妊娠17周时，气管和支气管中的所有TP63⁺细胞的TP63和KRT5共表达。然而，即使在妊娠19周时，远端细支气管中仍存在罕见的TP63⁺和KRT5^-细胞。总之，这些数据表明核pSMAD⁺和TP63⁺细胞不是真正的基底细胞，因为它们缺乏KRT5表达。相反，成熟的人类胚胎基底细胞TP63和KRT5共表达，并且缺乏核pSMAD表达。我们推测pSMAD⁺/TP63⁺/KRT5^-细胞可能是未成熟的呼吸道祖细胞，类似于早期小鼠呼吸道中的细胞，并且三天后在体外双重激活SMAD。

SMAD诱导呼吸道类器官的增殖

鉴于DSA诱导的类器官停止增殖，并且其他的工作显示基底细胞可以在双重SMAD抑制条件下进行体外培养，研究者认为在第3天类器官中的TP63⁺/KRT5^-细胞（图1）可以克服增殖缺陷并分化为成熟的呼吸道细胞（在适当的培养基中培养）（图2D）。在类器官增殖的筛选中，我们发现FGF10、Y27632以及TGFβ-1和BMP抑制剂（DSI培养基：FGF10、A8301、NOGGIN和Y27632）可以恢复一些DSA诱导的类器官的形成；但是，许多类器官没有在DSA处理中幸存下来。用DSA处理芽尖类器官祖细胞，然后DSI处理7天，导致一些TP63⁺细胞与KRT5共表达，并增加了其他经典呼吸道细胞标记基因的水平，例如FOXJ1（多纤毛细胞）和SCGB1A1（分泌细胞）。用DSA和DSI处理的芽尖类器官祖细胞显示，用DSA预处理在10天后显著增加TP63表达（图2F）。与成年人类肺生长的类器官的研究一致，我们发现诱导的类器官在DSI增殖培养基中生长21天，并证明了表达的呼吸道细胞标记蛋白。类器官显示了胚胎呼吸道分泌细胞（SCGB3A2⁺/SFTPB⁺）、多纤毛细胞（FOXJ1⁺，ACTUB⁺）、棒状细胞（SCGB1A1⁺）、杯状细胞（MUC5AC⁺）和神经内分泌细胞（CHGA⁺，SYN⁺）、TP63⁺细胞以及一部分TP63⁺/KRT5⁺基底样细胞的亚群（图2G）。DSA-DSI处理的类器官中的蛋白染色显示，与3F培养的对照相比，处理的类器官中pSMAD染色显著降低，尽管这是可以预期的，因为处理后的类器官在SMAD抑制培养基中可以增殖。尽管存在SMAD抑制剂，但在处理过的类器官的腔侧TP63^-细胞中仍可检测到低水平的pSMAD2，而在DSA-DSI处理过的类器官中未检测到pSMAD1，5，8。培养几天后，类器官中存在很多的多纤毛细胞，并且类器官中的腔内物质似乎呈方向性旋转，表明多纤毛细胞具有功能并能够推动腔内物质。这些结果表明，DSA诱导以及DSI诱导刺激芽尖类器官向近端呼吸道表型分化。

图2 胚胎肺中的SMAD信号及SMAD抑制TP63⁺类器官增殖

单细胞转录组定义正在发育的人类肺中的芽尖祖细胞和基底干细胞特征

为了确定体外产生的细胞是否与人类胚胎肺中的细胞相似，研究者对妊娠11.5至21周的人类胚胎肺组织中分离的整个远端肺、小呼吸道和气管上皮细胞进行了scRNA-seq（图3A）。研究确定了多种免疫、内皮、间充质和上皮细胞群。对提取的8443个上皮细胞利用典型上皮标记基因的表达鉴定细胞簇，然后对这些细胞进行了进一步的聚类，并使用tSNE可视化（图3B）。基于此分析，鉴定了12个上皮细胞簇，并根据已知的标记基因指定了细胞簇身份（图3C）。鉴定了多个已知的肺上皮细胞群，包括芽尖祖细胞（BP-细胞簇5）、基底细胞（BC-细胞簇7）和分化的细胞类型，包括多纤毛细胞（MC-细胞簇2）、神经内分泌细胞（NE-细胞簇3）、棒状和杯状分泌细胞（CS，GS-分别为细胞簇10和12）。此外还鉴定了两个以前未报道的上皮细胞簇，作者将其称为芽尖邻近细胞（BA-细胞簇6）和分泌祖细胞（SP-细胞簇4）。细胞簇6的芽尖邻近细胞共表达了独特的基因组合，包括芽尖祖细胞标记基因（低SFTPC，ID2）以及经典的AECI标记，例如HOPX、PDPN和AGER（图3C和3D）。人类胚胎肺在16周时的蛋白染色显示，这些细胞在物理上位于SOX9⁺芽尖附近，并且是PDPN⁺/AGER⁺/SOX9^-的状态（图3E）。细胞簇4中的细胞表达高水平的SCGB3A2、SFTPB和CFTR，并且不同于其他分泌性细胞群。例如，它们不表达棒状细胞标记基因SCGB1A1（图3C），也不与成人或小鼠肺中报道的任何已知细胞类型匹配。

作者确定了人类胚胎芽尖祖细胞和基底干细胞的独特基因特征，并验证了蛋白表达。人类芽尖祖细胞的典型标记基因的表达，包括SOX9、SFTPC、ETV5和ID2（图3C和3D）。在细胞簇5中表现出最强的表达富集，表明它是芽尖祖细胞簇。此外，将芽尖祖细胞簇中表达的基因与其他所有细胞簇中表达的基因进行比较，研究鉴定出最富含芽尖祖细胞的标记基因，从而确定了人类胚胎芽尖祖细胞在妊娠11.5-18周的转录特征（图3C）。胚胎肺组织中的免疫荧光染色证实了几种芽尖标记蛋白的表达（图3E）。

为了研究基底干细胞的特征，作者首先根据典型基底细胞标记基因TP63和KRT5的表达将基底细胞确定为细胞簇7中的细胞（图3C和3F）。此外，该细胞簇高表达了一组基因，包括KRT15、IL33、S100A2、F3、EGFR和PDPN（图3C和3F），蛋白染色验证了KRT5、IL33、F3、EGFR、KRT15和PDPN基因在妊娠17周时气管中的TP63⁺细胞内表达（图3G）。在基底细胞富集的基因中，EGFR和F3是在基底细胞中独特共表达的表面标记基因。研究鉴定了流式细胞荧光分选技术（FACS）抗体纯化的人类基底细胞（图3C和3G），并验证了EPCAM⁺分选及随后的EGFR⁺/F3⁺分选，从胚胎肺组织中富集了TP63⁺基底细胞。这些数据共同提供了人类发育中的肺上皮细胞中具有确定分子特征的上皮细胞的参考图谱。

图3 人类胚胎肺上皮细胞的细胞特征

体外的呼吸道细胞转录特征与胚胎呼吸道上皮细胞特征高度相似

为了了解类器官的细胞组成，并确定它们是否与胚胎肺的体内细胞类型相匹配，作者分析了分化之前芽尖类器官的2106个细胞（第0天），DSA处理的3天9400个细胞（第3天）和DSA诱导3天DSI诱导18天的类器官的3755个细胞（第21天的类器官）的转录组。利用tSNE对每个时间点数据进行降维，分别可以观察细胞异质性以及芽尖祖细胞（SFTPC和SOX9）和基底细胞（TP63、KRT5、KRT15）和其他细胞类型的标记基因的表达模式（图4A）。第0天的细胞只有一个同质细胞簇（图1C和4A）。SFTPC最初在第0天表达，到第3天时大大降低，但到第21天又在特定细胞中再次表达（图4A）。第3天和第21天细胞的聚类分别鉴定出7和11个细胞簇。TP63在第0天的细胞中不存在，但到第3天在26％的细胞中检测到，而在第21天在亚细胞中（13％）检测到（图4A）。为了获得整个处理过程中基底细胞转录组特征，研究总结了331个体内胚胎基底细胞标记基因的表达作为基底细胞标记，并检查了这组基因在体外来源的细胞的平均表达。诱导第3天和第21天的类器官细胞显示基底细胞标记基因的上调（图4B）。同时，与第3天相比，第21天类器官显示了特定细胞中基底细胞特征的进一步上调（图4B）。

为了评估体外来源的细胞与体内胚胎肺上皮细胞之间的转录组相似性，作者使用皮尔逊相关系数对每个细胞与体内上皮细胞簇基因表达的相似性进行了定量（图4C）。体外芽尖祖细胞的所有细胞（第0天）与体内芽尖祖细胞的基因表达相似性最高（图4C）。用DSA处理3天（第3天）的类器官中的大多数细胞与芽尖祖细胞最相似，而其中一些则显示出与芽尖邻近细胞、粘膜下基底细胞或基底细胞略高的相似性（图4E）。SMAD诱导的细胞与人类呼吸道中发现的细胞类型蛋白染色一致，第21天的类器官与多纤毛细胞、神经内分泌细胞、SCGB3A2⁺/SFTPB⁺/CFTR⁺分泌细胞、芽尖邻近的细胞和基底细胞相似（图4E和4F）。在第21天的细胞中使用tSNE发现，每个细胞均被相关的体内细胞簇染色（图4F）。每个细胞群体的单个标记基因的表达显示出一致的模式。体外来源的TP63⁺细胞也表达KRT15和低水平的KRT5。总之，该分析表明，DSA诱导，然后芽尖类器官祖细胞的DSI增殖，产生了呼吸道细胞，概述了发育中的人类呼吸道的分子特征。

鉴于在两种环境显著不同的情况下，体外来源的细胞的转录特征不可能完全等同于体内细胞类型。为了进一步探讨体外和体内细胞类型之间的差异，我们对这些细胞进行了比较，检查每个胚胎上皮细胞簇的标记基因与体外第3天和第21天细胞簇的标记基因之间的重叠。总体而言，该分析表明体外和体内细胞簇之间的相关性很强。然而，即使这些细胞具有遗传和功能上的相似性，在体外或体内环境下仍然存在重大差异。接下来，我们深入了解潜在的信号传导机制，这些机制可能是SMAD激活和抑制对芽尖祖细胞产生的影响。为了确定涉及的转录因子和其他调控元件，我们使用pySCENIC软件分析了第3天（SMAD激活阶段）和第21天（SMAD抑制阶段）单细胞数据。该软件可从scRNA-seq数据中预测转录因子、基因调控网络和细胞类型。为了确定与TP63⁺细胞基因特征相关的基因调控网络，我们选择了在TP63⁺细胞中高表达的靶标基因。在TP63⁺细胞相关的基因调控网络中，未鉴定出SMAD家族成员的转录因子，但根据MsigDB软件，预测某些转录因子结合SMAD，表明SMAD因子可能在直接调节TP63表达的转录因子上游发挥调节作用。我们进一步发现，在第3天和第21天时间点之间SMAD家族间接调控的TP63⁺细胞相关调控因子有所不同。

图4 体外诱导的呼吸道类器官细胞再现体内胚胎呼吸道细胞的分子特征

体外的TP63⁺细胞可分离，并具有单细胞扩增、自我更新和多系分化的特性

作者试图确定体外来源的TP63⁺细胞是否具有基底干细胞的功能特征，包括细胞的分离扩增、自我更新以及将多谱系分化为呼吸道细胞类型（如多纤毛细胞和分泌细胞）的能力。为此，使用富含基底细胞的细胞表面蛋白EGFR和F3通过FACS分离了TP63⁺细胞，利用免疫荧光染色它们与TP63⁺在诱导的类器官中共表达（图3C，5A-5C）。芽尖类器官用DSA处理3天，并在DSI培养基中增殖18天（图5A）。随后将类器官分离，并使用FACS分离EGFR⁺/F3⁺细胞（图5C）。每个生物重复分离的EGFR⁺/F3⁺双阳性细胞的百分比从5.84％到25.9％不等，反映了重复之间的差异。将来自所有3个生物学重复的FACS分离的细胞固定在载玻片上，并对TP63蛋白表达进行染色。该分析显示92.09％的EGFR⁺/F3⁺细胞共表达核TP63，而8.09％的EGFR^-/F3^-细胞表达核TP63（图5D和5E）。作者还观察到样品中有许多EGFR⁺/F3^-和EGFR^-/F3⁺细胞（图5C），其中大多数不是TP63⁺（图5D和5E）。分选后，将一部分EGFR⁺/F3⁺细胞重新铺板，并在DSI培养基中体外生长。如蛋白染色所示，类器官的EGFR⁺/F3⁺单细胞悬液包含TP63⁺基底样细胞，MUC5AC⁺杯状样细胞，SCGB1A1⁺棒状样细胞和AcTUB⁺/FOXJ1⁺多纤毛细胞（图5F，5G）。对于每个生物学重复的每个染色，至少计数了5个类器官。在未经处理的对照中不存在这些细胞类型。有趣的是，EGFR⁺/F3⁺呼吸道类器官中未检测到神经内分泌细胞，但存在于未分类的DSA-DSI处理的类器官中（图5F）。神经内分泌细胞的缺乏可能表明神经内分泌细胞很早就出现在发育中，直接来自芽尖祖细胞。此外，源自分选细胞的类器官表现出功能性多纤毛细胞，这些细胞伴随着管腔内容物旋转。

为了检测EGFR⁺/F3⁺类器官细胞是否表现出增殖特性，将芽尖祖细胞类器官用DSA处理3天，随后用DSI处理。在DSI中培养2周后，利用表达GFP或mCherry的慢病毒感染了不同批次的类器官，以便随时间跟踪和可视化这些细胞。类器官在DSI中再培养2周，使用FACS分离EGFR⁺/F3⁺细胞。将来自每种条件（GFP感染或mCherry感染的类器官）的分选细胞单独或混合接种，以评估克隆细胞群是否形成。在所得的类器官中，整个类器官要么全部由GFP⁺细胞或RFP⁺细胞组成，要么对两个荧光报告分子均呈现阴性，表明并非所有EGFR⁺/F3⁺细胞都被标记。没有观察到由GFP/RFP或荧光和非荧光细胞组成的嵌合类器官。这表明单个类器官来自单个细胞，而不是细胞聚集（图5H）。总之，这些数据表明，DSA诱导的类器官的基底细胞具有功能。

图5 体外培养的基底样细胞产生克隆性呼吸道类器官细胞

讨论

本研究展示了人类胚胎芽尖祖细胞能够产生包括基底细胞在内的功能性肺呼吸道细胞，SMAD信号有效刺激芽尖细胞分化为近端呼吸道上皮细胞。

与先前在小鼠中的研究一致，作者发现同质的人类芽尖类器官祖细胞能够产生呼吸道细胞。Cre介导的小鼠谱系追踪显示，只有早期（<E9.5）Sox9⁺上皮祖细胞会产生气管上皮和基底细胞。尽管在小鼠中基底细胞只限于气管上皮细胞，但它们在人类的支气管中延伸很远，这表明随着呼吸道的分支，人类芽尖祖细胞会产生肺内基底细胞（图1A）。作者从12周胚胎肺部获得的数据表明，沿着细支气管的长度发现了TP63⁺细胞，体外生长的12周人类芽尖祖细胞保留了产生多种呼吸道细胞类型（包括基底细胞）的能力。此外，SMAD信号在3天后强烈诱导芽尖祖细胞类器官中TP63的表达，但未启动完整的基底细胞标记基因。相反，这些细胞的行为类似于呼吸道祖细胞，产生了包含多种呼吸道细胞类型（包括功能性多纤毛和分泌细胞）的类器官。这些数据的另一种可能解释是，双重SMAD激活可向芽尖祖细胞提供一般信号，以启动近端细胞命运，随后还会出现进一步的细胞谱系特征。这些研究表明TGFβ-1和BMP4在调节小鼠呼吸道的近端至远端分化中都起着作用。

在发育中的小鼠肺中，分别在E14.5或E15.5之前不会出现多纤毛细胞和分泌细胞，这表明分化前呼吸道内的细胞是SOX2⁺呼吸道祖细胞。因此，芽尖祖细胞不一定直接产生功能成熟的呼吸道细胞类型，而是细胞在功能成熟之前先经过中间祖细胞状态。本研究表明，人类胚胎肺中可能存在中间祖细胞，但需要额外的工作来确定谱系关系。单细胞转录组学分析鉴定了两个以前未报道的细胞群。这些细胞种群中的第一个种群是芽尖邻近细胞，它们在体内12至20周的胚胎肺中与芽尖细胞物理邻近，并且这些细胞表达了肺泡细胞类型的典型标记基因。这些细胞种群中的第二个种群与分泌细胞共享转录谱，也共表达一系列基因和蛋白质的组合，其中包括高水平的SCGB3A2、SFTPB和CFTR。有趣的是，这些细胞不太可能是离子细胞，因为它们缺乏FOXI1表达，并且在转录组上不同于棒状和杯状细胞簇。据报道，在发育中的小鼠肺中有一群SCGB3A2⁺/UPK3A⁺分泌祖细胞，谱系追踪显示它们是棒状和多纤毛细胞的前体。目前的研究尚未解决SCGB3A2⁺/SFTPB⁺/CFTR⁺与最终分化细胞之间的谱系关系。然而，我们也证明在DSA诱导的类器官中存在类似的细胞群。

先前使用小鼠遗传学研究小鼠气管和呼吸道中SMAD信号的研究以及使用人类体组织的研究表明，成熟的气管基底细胞中不存在核磷酸化的SMAD。与此相一致，培养的基底细胞需要SMAD信号抑制才能在体外维持其增殖和未分化状态。目前的工作描述呼吸道中SMAD信号的动态双重作用。与成人呼吸道类器官的报道一致，但与先前发表的二维培养研究相反，表明SMAD抑制作用阻止了基底细胞的分化。作者发现SMAD的抑制使类器官分化为呼吸道样细胞，尤其是在类器官内腔的细胞内分化，并且观察到内腔细胞中存在一些pSMAD2，这表明3D环境可能允许类器官内的SMAD活化和分化。芽尖类器官的基底细胞的增殖和成熟发生在SMAD抑制环境中，这与先前的研究一致。值得注意的是，我们在人类胚胎呼吸道中较不成熟的细胞中的TP63⁺细胞中观察到了较低的核pSMAD信号，这表明SMAD激活可能与肺内呼吸道中TP63⁺细胞的产生有关。然而，仍有待确定TP63⁺/KRT5^-/pSMAD^-细胞是否继续在成年呼吸道中产生真正的基底细胞，或它们是否代表短暂的近端呼吸道祖细胞。

评论

总之，这项工作表明，SMAD激活诱导TP63表达，并与未分化的芽尖类器官祖细胞相似，从而最终导致呼吸道细胞类型（包括基底细胞）的出现。此处提供的资源为进一步研究人类胚胎肺中的细胞关系以及针对体内和体外细胞群体的研究结果奠定了基础，并为人类体外多能干细胞生成呼吸道和基底细胞的方法提供了信息。

---

更多推荐

1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响

2 重磅综述 | Cell：非编码RNAs在肿瘤学中的作用（IF=36.216）

---