科研 | Environmental Pollution：转录组分析揭示了环境相关浓度的氯氰菊酯对蜜蜂的影响
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Global transcriptome analysis reveals relevant effects of environmentally relevant concentrations of cypermethrin in honey bees (Apis mellifera)
译名：转录组分析揭示了环境相关浓度的氯氰菊酯对蜜蜂的影响
期刊：Environmental Pollution
IF：5.7
发表时间：2019.12.4
通讯作者：Karl Fent
通讯作者单位：瑞士西北应用科学与艺术大学
DOI号：10.1016/j.envpol.2019.113715
实验设计
本研究中，试验将通过使用转录组分析评估成年蜜蜂工人大脑中氯氰菊酯的亚致死浓度的分子效应，从而扩展了当前的知识。将蜜蜂的大脑作为氯氰菊酯的主要靶点，主要通过使用RNA测序（RNA-seq），然后通过RT-qPCR验证所选靶基因的转录物的丰度，并充分了解氯氰菊酯的分子作用及其作用方式。
结果
1 氯氰菊酯诱导的差异表达基因
通过RNA测序对蜜蜂进行48h口服处理后、两种浓度下氯氰菊酯的基因组转录图谱进行评估。对所有15个重复样品进行质量分析，每个溶剂对照（DMSO）重复5次，对氯氰菊酯进行0.3和3 ng/bee的氯氰菊酯处理，结果表明，两个溶剂对照重复样品和一个3 ng/bee重复样品处理表现出非常不同的表达模式。因此，将这些重复项排除在进一步分析之外。剩下的12个重复样品在与三个条件的相关性方面产生了非常好的结果。每个条件都根据其表达模式都清楚地聚类在一起。重复的从头组装产生总共产生183736个转录物，其可被概括为99003个编码区，即DEG，GC含量为36.9％。平均重叠群长度为1037.6 bp。将Illumina测序结果映射到转录组装配体，所有重复的映射率均超过85％。通过序列分类系统Kraken 2搜索，发现只有504个转录本（0.27％）可以分配给潜在污染。因此，数据的质量非常好。DEG的数量与浓度有关。在99003个DEG中，只有38个被显著差异表达，即log2倍数变化（log2FC）> 1（表示高于两倍表达），且错误发现率（FDR）校正后的p值<0.05，3 ng/bee处理后DGEs为265个，两种氯氰菊酯浓度处理后为24个（图1）。绝大多数差异表达被上调（82.9％），分别为，0.3 ng/bee和3 ng/bee处理分别有29个和209个DEG。
3.2 差异表达基因的功能分析
为了解差异表达的DEG的潜在功能相关性，通过基因本体（GO）富集分析对从头组装中的预测基因序列进行功能注释。显著（p <0.01）的富集的GO 项分为生物过程（BP），分子功能（MF）和细胞成分（CC）三类。图2A-C显示了两种处理浓度下DEG的功能。在0.3 ng/bee的氯氰菊酯接触量中，有89个重要的GO含量富集。大多数高度丰富的GO项与肌肉过程有关。氯氰菊酯浓度最高的五个GO项显然与肌肉发育，结构和组织有关（图2）。在分子功能和细胞成分类别中，肌肉结构和功能过程得到了丰富。在3 ng/bee的氯氰菊酯处理中，富集了35个重要的GO项。与较低的处理水平一样，高度显著的丰富类别与肌肉结构和过程相关。另外，在分子功能类别中，参与脂肪酸合成的酶（脂肪酸-CoA-合酶）富集。在生物过程类别中，脂肪酸的生物合成过程也很丰富（图2B）。这表明当处理于较高的氯氰菊酯浓度时脂质代谢发生改变。总体而言，GO分析表明，重要的DEG与肌肉结构和过程相关，并且大多数GO项在两种处理浓度之间是常见的。
3 KEGG通路分析
为了探究涉及DEG的潜在途径，研究人员用KEGG注释和途径对其进行表征。0.3 ng/bee和3 ng/bee处理后的DEGs被定义为扩张型和肥厚型心肌病，间隙连接，MAPK信号通路和致病性大肠杆菌感染的途径。突出的途径还涉及与代谢途径有关的几种酶，脂肪的消化和吸收，甘油-脂类代谢，维生素的消化和吸收，N-聚糖的生物合成和次生代谢产物的生物合成。两种氯氰菊酯治疗方法共有的差异表达基因是纤体蛋白，微管蛋白β和ras反应性元素结合蛋白1，后者被分配给MAPK信号通路。
4 RT-qPCR分析
研究人员在大脑样本中进行了RT-qPCR分析，其中选择了9种DEG，这些DEG显示出RNA-seq的显著变化，并且可以设计出用于验证RNA-seq数据的引物。图3显示在一种或两种处理浓度下显著诱导了七个选定基因转录本的丰度。将RNA测序数据与RT-qPCR的数据进行比较显示，两种浓度下的所有转录本都具有良好的匹配性（图4），尽管某些转录本中RNA测序的倍数变化略高，例如酯酶B1，ABHLP和ILGFT。因此，RT-qPCR数据证实了RNA测序数据的质量和可靠性。另外一个试验确认来自于对另外9个基因转录本的测定，其中3个在研究人员之前的研究中被诱导，如乙酰胆碱受体α1和α2以及卵黄原蛋白。两项研究之间的RT-qPCR数据与卵黄原蛋白明显匹配，而乙酰胆碱受体α1和2的显著诱导在目前的研究中尚不能得到证实。
讨论
这项研究是蜜蜂中氯氰菊酯的首次转录组分析，因此，增进了对蜜蜂中拟除虫菊酯杀虫剂作用的认识。研究结果显示氯氰菊酯影响许多重要途径，包括肌肉结构和功能以及其他蛋白质，主要参与代谢过程。氯氰菊酯的神经毒性基于与神经元电压门控钠通道的结合和延长，导致中枢神经系统过度兴奋。尽管氯氰菊酯的基本生理作用模式是生理神经元功能的破坏，但结果表明，在涉及多种途径的基因表达水平上会发生其他影响。研究表明，氯氰菊酯的主要作用与肌肉系统有关，该肌肉系统涉及肌联蛋白titin, 颤搐蛋白twitchin和肌球蛋白myosin（图2）。GO分析表明，在两种氯氰菊酯浓度下，肌肉发育，肌肉结构和组织以及肌肉功能是大脑中受影响的关键过程。
两种氯氰菊酯浓度均显著诱导了编码酯酶B1A的基因的转录本。酯酶B1是一种酶，蜜蜂中的基因出现在具有10个外显子的染色体LG1上。该酶可能在递质调节和代谢功能中具有调节功能，它也被有机磷酸酯杀虫剂诱导。杀虫剂抗性可能是由于其基因扩增或突变所致。因此，类似于有机磷酸酯，通过氯氰菊酯诱导乙酰胆碱酯酶B1转录物可被视为对氯氰菊酯处理的反应的补偿和抗性机制。在较高的氯氰菊酯处理量（3 ng / bee）中，许多GO项富集了脂质的生物合成。在酶的分子功能类别中（脂肪酸-CoA-合酶），在生物过程类别中，脂肪酸生物合成过程（图2B）。这表明较高的氯氰菊酯浓度引起参与脂肪酸合成和脂质代谢的酶的增加。KEGG分析显示了与肌肉功能（扩张型和肥厚型心肌病）相关的代谢途径，这证实了通过DEG名称和GO分析获得的数据。此外，MAPK信号传导途径和包括葡萄糖1-脱氢酶在内的多种代谢途径（次生代谢产物的生物合成）也发生了改变。此外，用9个选定的靶基因进行的RT-qPCR验证，结果证实了RNA测序数据的可靠性（图4）。
综上，研究表明，氯氰菊酯对蜜蜂的转录水平上有很大影响，编码与肌肉发育、结构和功能相关蛋白质的基因，以及涉及代谢和排毒的酶在大脑中被诱导表达。这些转录变化可能会一起转化为生理水平的不良结果，但结果应需进一步研究。
评论
氯氰菊酯是农业和家庭中常用的拟除虫菊酯，但其慢性分子作用仍然难以捉摸。本文通过RNA测序描述了亚致死氯氰菊酯暴露对蜜蜂大脑中整体转录组的影响。在这两种浓度下显著诱导24个DEG，其中涉及编码肌肉结构、肌肉过程和酯酶B1的基因。并通过RT-qPCR确定9个DEG的上调与RNA序列数据显示出良好的相关性。本研究首次证明了氯氰菊酯在环境浓度下的分子作用，包括编码肌肉和细胞过程以及代谢酶的基因的表达诱导。
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