科研 | Rice：基于杂草稻幼苗转录组的耐冷机制综合评价与分析（国人1区佳作）
编译：菜鸟菠萝，编辑：十九、江舜尧。
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杂草稻(Oryza)是栽培稻(Oryza sativa L.)的近缘种。它具有很强的非生物胁迫抗逆性；然而，人们对其耐冷性的综合机制研究较少。本研究以空育131为耐寒对照，采用综合评价指数D对133份杂草稻品种的耐冷性进行了评价。133个品种中有39.8%的品种被鉴定为耐冷性强的品种，说明杂草稻群体总体上确实具有较强的耐冷性，并鉴定出两个耐冷性强的品种，分别为WR29和WR157。回归分析表明，氮含量指数、超氧化物歧化酶含量（SOD）、丙二醛（MDA）含量等指标与耐冷性显著相关(P<0.0 5)，可作为鉴定耐冷性的指标。通过对本研究中鉴定的耐冷品种WR157的转录组分析，与对照组相比，处理组共鉴定出4645个DEGs，其中2123个上调DEGs，2522个下调DEGs，在2123个上调的DEG中有911个属于98个 KEGG类别，在2522个下调的DEG中有1103个属于115个类别。进一步分析表明，GO:0019740和GO:0006808与氮素利用有关；GO:0009269和GO:0009414与胁迫反应有关；GO:0016491和GO:0016614与氧化还原酶活性有关。同时，基于5个形态指标和9个生理指标的综合评价，揭示了不同地区杂草稻品种的耐冷性，并通过转录组分析揭示了一些与耐冷性相关的指标。研究结果为进一步的耐冷性研究提供了可靠的评价方法，并揭示了一些与耐冷性相关的基因，这将有助于研究人员培育栽培稻品种以提高其耐冷性，同时这些性状有助于提高幼苗的成活率和生长能力，以及未来的产量。
论文ID
原名：Comprehensive Evaluation and Analysis of the Mechanism of Cold Tolerance Based on the Transcriptome of Weedy Rice Seedlings
译名：基于杂草稻幼苗转录组的耐冷机制综合评价与分析
期刊：Rice
IF：3.513
发表时间：2020年2月
通讯作者：张辉、韩龙植
通讯作者单位：中国农业科学院作物研究所
DOI号：10.1186/s12284-019-0363-1
实验设计
水稻（Oryza sativa L.）是最重要的主食作物之一，而非生物胁迫严重影响其产量，其中冷害对栽培稻的生长和产量影响最大。杂草稻作为它的近缘种，尽管它的谷物产量较少，同时是耕地稻田中的一种草害。但杂草稻对胁迫（冷，干旱和盐分）具有很强的抵抗力。
本文以133种杂草稻品种中的30个品种为主在中国科学院温室中进行实验。以空育131（强耐寒品种）为对照，在相同条件下生长至3.5叶期。将冷寒处理组转移到自然低温条件下，其它条件与仍在原始生长环境中的对照组的条件一致。每天将幼苗自然低温处理12h（早8:00~晚20:00），处理7天。根据水稻的标准方法评估耐寒性，于0、3、7d统计叶片枯萎度（LWD），将处理过的幼苗恢复7d后，统计对照及处理组存活率（SR= Ts/CKs）、叶绿素含量（CRI）= Tc/CKc）及氮含量指数（NRI= Tn/CKn）。使用SPSS 17.0进行PCA（主成分分析）分析，相关性和显著性分析。通过综合评价指数D筛选出6个耐寒材料WR16，WR21，WR20，WR155，WR164和WR157。然后测定这6个材料的SOD，CAT，TPI，MDA，Pro，ATPase，ABA，Chl和GSH等指标，评价这6个材料耐寒性，筛选出耐寒性强的材料WR157。以强耐寒性材料WR157为主进行转录组测序分析。
结果
1 基于5种形态指标的耐寒性评价
通过PCA分析将5个形态指标生成了两个综合指标，CI（1）和CI（2），分别有54.54%和32.01%的贡献率，累积贡献率达到86.55%（Table1）。通过综合指数计算苗期耐寒性的综合评价值D，根据D值进行耐寒性评价，D值越大，耐寒性越强。其中WR29的D值为0.8328，WR157的D值为0,8219。对照空育131的D值为0.8181，表明WR29和WR157比对照空育131的耐寒性更强，共筛选出6个材料。而通过回归分析结果表明NRI与耐寒性显著相关（r=0.926，P<0.01），表明NRI是一个耐寒性评估的关键性指标。
Table 1综合指数CI（x）和贡献率
2 基于生理指标的耐寒性综合评价
6个材料的9个生理指标的PCA分析表明，前3个的CI的贡献率达到了93,84%（Table 2），计算综合耐寒性指数pD（Table 3）结果表明，WR157具有最大相对耐寒指数，WR155则具有最小耐寒指数（Fig1）。回归分析结果表明，SOD和MDA是评估耐寒性的重要指标（Fig2,Fig3）。pD的SOD值（r=0.971，P<0.01）与pD的MDA的值之间存在显著的正相关（r=0.921，P<0.01）（Fig2,Fig3）。针对形态和生理的耐寒性综合分析，筛选了与耐寒性显著相关的性状，并基于转录组分析，关联分析这些性状与耐寒性相关途径。
Table2综合指数p CI（x）和贡献率
Table3每个品种不同的综合评价值
Fig1 6个材料的9个生理指标的耐寒性变化趋势
Fig2 6个材料的SOD变化
Fig3 6个材料额MDA变化
3 基于转录组学的苗期耐寒性分析
选择抗寒性强的品种WR157用于转录组分析。共鉴定出4645个差异表达基因，分别有2133个上调差异表达基因和2552个下调差异表达基因（Fig4），上调差异表达基因中1721个被注释，其中226个基因被命名，226个基因中有10个基因显著上调（log2倍数变化> 5.0）。下调差异表达基因中，1886个被注释，210个基因被命名，210个基因中有14个基因显著下调（log2倍数变化<-5）（Fig4）。
Fig4 WR157T和WR157CK之间上调（红色）和下调（绿色）的差异表达基因（共4645个DEG）
4 基于差异表达基因的GO分析
通过GO分析表明，所有上调表达的差异基因中545个富集在分子功能，694个富集在生物学过程中，149个富集在细胞组成中（Fig5）。在下调的中，612个富集在分子功能，772富集生物学过程，182个富集在细胞组成。其中上调表达的差异基因（共175个terms显著富集）中（Over_represented_pValue<0.05），在生物过程中富集了113个，在分子功能中富集了51个，在细胞组成中富集了11个；下调基因（共182个terms显著富集）中在生物过程中富集了120个，在分子功能中富集了51个，并且在细胞组成中富集了11个。基于上述差异表达基因，分析了显著富集的前20个terms（p<0.05），其主要分布在细胞组成和生物过程类别中，包括细胞部分，细胞内和细胞生物合成过程，细胞内部分，细胞内细胞器，细胞器，细胞大分子生物合成过程，大分子生物合成过程，基因表达，细胞质和核糖体（Fig6）。其中GO:0019740和GO:0006808参与了氮的利用，这与我们将NRI与耐寒性相关的发现相一致。 GO:0009269和GO:0009414与胁迫响应有关，这表明这些DEG与耐寒性有关。GO:0005623和GO:0044464显示了与细胞组成有关，其中有1072个DEG富集；GO:0016491显示了与氧化还原酶活性相关，其中有266 个DEG的富集；并且GO:0016614，GO:0016616，GO:0016667，GO:0016627和GO:0016715均与氧化还原酶活性相关，这支持我们使用MDA和SOD作为耐寒性评估指标。
Fig5 GO富集分析；*：pValue<0.05
Fig6 前20个term富集的DEG数
5 KEGG通路分析
KEGG通路分析结果表明，在2123个上调的DEG中有911个属于98个KEGG类别，在2522个下调的DEG中有1103个属于115个类别。上调表达的可分为9类（Fig7，Fig8），其中核糖体途径有55个DEG；表明该途径可能调节应激诱导基因的表达。植物激素信号转导途径有42个DEG，表明这些途径也可能与胁迫反应有关。氨基酸的生物合成途径富集36个DEG；植物与病原体的相互作用途径富集了35个DEG；苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸（三种必需的芳香族氨基酸）的生物合成途径富含13个DEG。磷脂酰肌醇信号传导途径有11个DEG，肌醇磷酸代谢途径有10个DEG，2-oxocarboxylic acid代谢途径富集10个DEG。
Fig7 根据KEGG分析，在WR157T和WR157CK中上调DEG的通路富集分析。
Fig8 KEGG通路中每个类别中显著上调的DEG数量
讨论
杂草稻耐寒性评价
对于每种杂草稻，其恢复指数反映了其耐寒性。在这项研究中，研究者根据SR，CRI，NRI和LWD的值选择了综合恢复指数D，并选择RLWD7来评估耐寒性。通过回归分析，结果发现NRI与耐寒性相关，因此不仅可能是耐寒性的组成部分，而且可以作为水稻耐寒性的评估指标。对DEG的GO分析表明，GO:0019740和GO:0006808与氮的利用和调节有关，这证实了NRI在对抗冷害方面确实起着重要作用。此外，参与光合作用相关的GO:0009765，GO:0019684和GO:0015979也表明叶绿素也可以是耐寒性评估的重要指标。同时，叶绿素含量也是用作非生物胁迫的指标。而SOD可用作鉴定杂草稻耐冷性的生理指标，因此研究者测量了6个品种的SOD活性，发现pD和SOD活性（Fig2）以及pD和MDA含量（Fig3）之间存在显著的正相关。因此，pD值可用于对不同水稻品种的耐寒性进行分类，而SOD和MDA对水稻的耐寒性评估产生关键影响。GO:0016491，GO:0016614，GO:0016616和GO:0016667与氧化还原酶活性有关，并且可以解释SOD活性和MDA含量作为重要评估指标。其它生理指标也可能与耐寒性相关：GO:0009415和GO:0009414与水分利用率相关，这表明耐寒性与抗旱性有关。
耐寒品种的转录组分析
所有显著上调或下调的DEG都与植物的抗逆性或抗氧化性有关。OS08G0189900编码类萌发素蛋白GmGLP10并增强了对细菌的抵抗能力。OS01G0566500可以缓解植物的氧化胁迫，这与在低温胁迫条件下产生的MDA和SOD有关；OS08G0509100与脂氧合酶的合成有关，同时激活大豆（Glycine max）的抗氧化能力等。
KEGG分析将上调和下调的DEG进行分类，其中主要为核糖体通路（Fig8）。该通路可能主要调节应激诱导基因的表达。核糖体是由蛋白质和rRNA组成的重要细胞器。随后的rRNA修饰主要发生在核糖体中，这些rRNA修饰在发育等相关过程中响应环境变化（寒冷，干旱和盐分）。这表明在不利条件下核糖体修饰有助于基因表达的翻译调控。同时还有植物激素信号转导通路，表明该通路与胁迫反应相关，如脱落酸（ABA），水杨酸和乙烯对非生物胁迫有一定作用。激素信号转导的交互性质使防御反应的介导成为可能。氨基酸的生物合成也可能在对压力的反应中起作用，有研究表明甘氨酸提高了水稻的耐冷性。
研究结果表明，基于5个形态指标和9个生理指标的综合评估显示，不同地区的杂草稻品种具有不同的耐寒性水平，并通过转录组分析筛选了一些与耐寒性相关的基因。该研究结果为进一步的耐寒性研究提供了可靠的评估方法，并揭示了一些与耐寒性相关的基因，这将有助于研究人员培育栽培水稻品种以提高其耐冷寒性。
评论
非生物胁迫对农业生产影响越来越大，特别冷胁迫影响水稻产量。目前有关耐寒性机制的研究较少，但其在预防和减少寒冷损害中起着重要作用。本文以133份杂草稻为材料，通过五个形态学指标评估了133个品种的耐寒性，以综合评价指数D筛选了6个耐寒性材料，同时以9个生理为主筛选出1个代表性品种（WR157），通过转录组分析来鉴定耐寒性并分析了耐寒性机理。为进一步研究水稻耐寒性机理提供了信息。
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