双荧光素酶报告基因检测实验步骤

一、检测原理全基因合成miR潜在结合位点上下游~500bp（LncRNA、circRNA或mRNA的3’UTR）野生形式WT及结合位点的突变形式Mut，克隆到psiCHECK-2多克隆位点处（1640-1674）（图1），然后与miR的mimics/NC共同转染293T细胞测定荧光素酶读值即可。

二、载体构建与Mimics合成1、构建WT miR潜在结合位点到psiCHECK-2载体，命名为WT；2、构建Mut miR潜在结合位点到psiCHECK-2载体，命名为Mut（突变模式：A/T与G/C互变）；3、合成待测miR的Mimmics及阴性对照NC。三、 实验分组信息psiCHECK- Target 序列miRTarget-11WTNC2WTMimics3MutNC4MutMimicsTarget-21WTNC2WTMimics3MutNC4MutMimics四、具体实验步骤：(一) 细胞转染操作步骤1、事先准备好用于转染的分到96孔板中的293T 细胞和目的质粒，待细胞密度达到50%-70%为宜。2、将10 ml DMEM与0.16 mg的lncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的质粒以及5 pmol的miR/Negative.Control（N.C）Mimics充分混匀后室温放置（溶液A）；然后将10 ml DMEM与0.3 ml 的转染试剂（转染试剂为汉恒生物产品LipoFiter，浓度为0.8 mg/ml）充分混匀（溶液B），室温放置5 min。3、将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min。4、转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37℃，5% CO2培养。5、转染6 h后换取新鲜培养基，转染48 h后收集细胞检测。(二) 检测实验操作步骤检测试剂盒：Promega Dual-Luciferase system1、将5´PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸馏水稀释至1´PLB，以96孔板每孔100 ml的量加入，用移液枪吹打打散细胞，置于室温摇床上缓慢摇15分钟后，将细胞裂解液吸至1.5 ml离心管，4度12000 rpm （13200g）离心10 min，取上清移入新的管子；2、96孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml；3、加入20 ml细胞裂解液，移液枪吹打混匀2-3次，测定记录Firefly luciferase值，此值为内参值。4、加入100 ml Stop & Glo® Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema)，移液枪吹打混匀2-3次，测定记录Renilla luciferase值，此即为报告基因发光值。五、 预期实验结果