基因组时代临床医生如何做到精准诊断遗传性肾脏病

摘要

虽然临床医生通过诊断性实验室（遗传检测机构或实验室）所提供的新的遗传学技术如二代测序及染色体芯片等极大地提高了对遗传性肾脏病的诊断，然而，要做到精准诊断此类疾病，首先需要临床医生能识别出可能的此类疾病患者，然后在熟知各种遗传检测方法的基础上依据患者表型选择恰当的分子诊断技术手段和合适的组织标本进行检测，获得的遗传检测报告需结合患者的表型、可能的遗传模式以及共识指南等进行临床解读，与此同时发挥研究性实验室功能，通过应病而设的技术方法解决诊断性实验室无法解决的特殊问题，最终为患者及其家庭提供精准诊治意见。

遗传性肾脏病广义上是指由于遗传物质结构或功能改变所导致的肾脏疾病；狭义上则指由于遗传物质结构或功能改变所致、按一定方式垂直传递、后代中常常表现出一定发病比例的肾脏疾病。此类疾病按照遗传病的分类可分为染色体病、单基因病、多基因病、线粒体病和体细胞遗传病，按照累及肾脏部位分为肾小球病、肾小管病、肾小管间质病、肾血管病、肾脏尿路畸形、肾囊肿和肾脏肿瘤。

自遗传学进入肾脏病领域的近40年里，遗传学、分子生物学和生物信息学的飞速发展带动并促进了对遗传和肾脏疾病关系的认识，且实现了对遗传性肾脏病的分子诊断。研究显示，遗传性肾脏病是成人慢性肾脏病最严重阶段终末期肾病五大常见原因之一，约占25岁前起病的慢性肾脏病患者的20%，占儿童肾移植患者的30%,可见遗传性肾脏病并不罕见。然而，此类疾病种类繁多，起病隐匿，临床表现常不特异，甚至直至进展至终末期肾病时才被发现，因此早期、及时确切的诊断此类疾病成为亟待解决的临床问题。新的遗传学技术如二代测序和基因芯片在临床实践中的广泛应用，提高了临床医生对遗传性肾脏病的诊断，但由此也产生了一系列问题，如哪些肾脏病需要分子诊断，如何选择合适的遗传检测方案，如何基于临床对诊断性实验室出具的遗传检测报告进行解读等。显然这些问题的解决是做到精准诊断遗传性肾脏病的关键一步，需要临床医生在提高对遗传性肾脏病识别力的基础上，掌握并及时更新遗传学知识，且与专业的实验检测专家、生物信息学家、遗传学家合作，充分发挥研究性实验室作用，进而为每一位患病个体及所在家庭的精准诊断、客观遗传咨询提供科学严谨的依据。

一、分子诊断的适应证

遗传检测的诊断价值仅限于具有遗传病因的疾病。也就是说，遗传检测适用于肾脏科医生依据专业知识高度怀疑某种肾脏病为遗传病。然而，如果将遗传检测作为除外某种肾脏病系遗传原因所致则是不合适的。

详细地收集表型（包括病史、体格检查、生化检查、肾组织病理检查、影像学检查以及家族史调查）对判断肾脏病有无遗传病因必不可少。相当数量的遗传性肾脏病在儿童期甚至婴儿期、胎儿期就出现症状，因此起病年龄早，特别是当临床对某种肾脏病诊断不清楚时往往被作为怀疑遗传病的依据之一。伴有肾外表现的肾脏病、双侧先天性肾脏尿路畸形、对包括激素在内的多种免疫抑制剂都耐药的肾病综合征以及有家族聚集现象的肾脏病均提示遗传病的可能。依据肾活检组织的特异性病理改变及一些生化检查如血乳酸水平、半乳糖苷酶α活性等可明确诊断某些肾脏病为遗传病。然而值得注意的是，对于小家系、呈常染色体隐性遗传的肾脏病和新发变异引起的肾脏病而言，通常缺乏家族史；遗传性肾脏病临床表现多样，而肾脏科医生关于此类疾病的认识往往基于小样本患者，且此类疾病的儿童患者可能尚未表现出有诊断价值的症状或肾脏病理改变，临床中采用的确诊方法非标准化等，造成临床医生很难判断某种肾脏病是否为遗传病，从而借助遗传检测寻找病因，而比较低的遗传检测阳性率则会误导临床医生放弃遗传性肾脏病的诊断。

此外，改善全球肾脏病预后组织在2017年活体供肾者的评估与护理指南指出，潜在活体供肾者患有导致肾衰竭的遗传性肾脏病时不可以作为捐献者。因此，建议潜在活体供肾者进行遗传检测，一则可以指导供体选择，再则有助于判断肾脏预后。

二、遗传检测方案的选择

目前在临床实践中用于分子诊断遗传性肾脏病的检测方法主要是基于基因组DNA水平的分析，而基于目标基因mRNA水平及编码蛋白水平的分析极少。

基于基因组DNA水平的检测方法大到可以检测染色体核型，小到可以检测基因中单个碱基的改变。目前常用的遗传检测方案包括对基因变异的检测和对拷贝数变异的检测。其中对基因变异的检测通过一代测序和二代测序，二代测序又包括目标序列靶向捕获测序、全外显子组测序和全基因组测序；对拷贝数变异的检测主要通过染色体微阵列分析。国内外已有文章就上述遗传检测技术的优点、缺点及适用范围进行了详细的论述。遗传检测方案的选择必须基于患者的临床表现，因此要求对患者进行深入细致的临床评估。如果所怀疑的遗传性肾脏病致病基因仅1个或几个，可以选择一代测序或特定疾病目标序列靶向捕获测序，如果因多器官畸形而怀疑基因组病则选择染色体微阵列分析，如果临床评估无定论但又高度怀疑遗传性肾脏病、表型具有高度遗传异质性或特定疾病目标序列靶向捕获测序结果阴性时可选择孟德尔遗传病目标序列靶向捕获测序、全外显子组测序或全基因组测序。

三、遗传检测报告的临床解读

尽管目前诊断性实验室出具的遗传检测报告依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics，ACMG）2015年"序列变异解读标准和指南"并结合人群与疾病数据库和生物信息分析工具对变异进行了分级与评价，但是并不能直接用于临床诊断，还必须评估变异是否与患者的临床表现一致。临床医生在对一份遗传检测结果进行有关变异致病性、遗传方式及与疾病关系的解读时需注意以下特殊情况。

1．致病性变异判断方面：

（1）当全外显子组或目标序列靶向捕获测序检测报告提示结果阴性，然而临床高度怀疑肾脏病与某个单基因有关时，要考虑到基因深部内含子和非翻译区的变异。目前全外显子组或目标序列靶向捕获测序仅检测分析与外显子交界20个碱基左右的内含子区域，无法覆盖深部内含子，而非翻译区的变异在数据初始分析时往往被过滤掉。由于目前对非编码区的研究较少，可供参考的注释数据不多，若怀疑上述位置存在致病性变异时，需要同时进行功能实验，可以提取能表达待检测基因的组织RNA进行深度测序，或将RNA逆转录为cDNA进行一代测序，从而明确非编码区是否存在致病性变异。（2）往往认为同义变异不会导致所编码氨基酸的改变，因此多数同义变异在分析数据时会被过滤掉，仅有位于外显子首位或末位的同义变异因有可能影响剪接而被关注；而在评价错义变异的影响时会综合参考编码氨基酸的进化保守性、正常及疾病人群数据库及生物信息学工具预测的结果。然而已有研究显示，非外显子首末位的同义和错义变异也可以改变剪接位点，影响mRNA的生成。一些功能预测软件如Human Splicing Finde、MutPred和MaxEntScan可以预测变异对剪接的影响，但预测的效能及准确性有限，可以通过体外微小基因实验模拟体内剪接过程，对临床意义不明的同义、错义变异功能进行分析。（3）虽然剪接位点变异在ACMG证据等级中被分为无功能变异（极强致病性变异证据），但一定需要通过RNA或蛋白质功能分析确认；当剪接位点变异导致框内缺失或插入，使得蛋白质的关键结构域得到保留，那么证据等级会因此降低（中等致病性变异证据）。

2．家系共分离分析确定变异来源并判断是否符合预期的遗传模式：

（1）新发变异是指子代基因组中存在的不同于父母基因组的变异，一般来自父母生殖腺嵌合（精子或卵子）或受精卵发育过程中的自发变异。判定新发变异患儿的父母下一胎再患病概率时，需要考虑到父母生殖细胞嵌合体的存在，这类患者再发风险取决于变异在生殖细胞发生的时间及变异细胞的比率。（2）非经典孟德尔遗传现象如单亲二体。单亲二体是指同源染色体或染色体上的部分片段均来源于父母中的一方，是卵子或精子形成期间或者是在胎儿早期发育中发生的随机事件，发病率较低，约为1/3 500。单亲二体可导致隐性基因发生纯合变异。因单亲二体导致的常染色体隐性遗传病呈非经典的孟德尔遗传模式，隐性致病基因仅来自父母一方；由于单亲二体是随机事件，因此下一胎再患病概率小，在解读基因报告和进行遗传咨询时应引起注意。（3）考虑常染色体隐性遗传性肾脏病的先证者通过靶向二代测序或一代测序检测到致病基因纯合变异，而父母外周血DNA经一代测序或定量PCR分析却仅在一方找到相应位点的杂合变异时，应考虑到潜在的遗传病理机制，包括点突变伴重叠区域外显子大片段缺失、单亲二体、生殖细胞嵌合、新发变异和等位基因脱扣。

3．分析表型特点与序列变异关系时需要注意：

（1）外显不全，并不是所有含显性致病基因致病性变异的个体都出现临床表现，这可能和生长发育、年龄和性别相关。（2）表现度差异，致病基因可引起不同患儿临床表现及严重程度不同。

四、研究性实验室助力精准诊断遗传性肾脏病

遗传性肾脏病精准诊断需要团队合作，需要临床医生、分子遗传学家、诊断性实验室和研究性实验室的专家保持密切的沟通和合作，最好定期共同就每例进行遗传检测的患者予以"剥丝抽茧"分析和讨论。

诊断性实验室无法解决上述提及的遗传检测报告临床解读注意的特殊情况，而研究性实验室则可有机地结合患儿、应疾病需要而设实验方案，对特殊问题进行求证、解决。常染色体隐性遗传病由位于同源染色体等位基因的纯合或复合杂合致病性变异引起，而真正的纯合变异更可能发生在近亲婚配的家庭中。北京大学第一医院儿科近期一项研究显示^[15]，6例来自非近亲婚配家庭的患有常染色体隐性遗传性肾脏病的先证者发现"特殊"纯合变异，即先证者通过二代测序或一代测序检测到致病基因纯合变异，但经验证后仅在父母一方发现相同变异，显然这与传统的孟德尔遗传规律不符，很难对先证者同胞复发风险作出准确评估。而在研究性实验室中通过更换引物后重复测序、单体型分析、基因组实时定量PCR和单核苷酸多态性分析的方法，证明了点突变伴重叠区域外显子大片段缺失、单亲二体、生殖细胞嵌合或新发变异是上述"特殊"纯合变异的遗传病理机制，进而为临床医生关于此类疾病有效的个性化管理、遗传咨询提供了科学依据，同时亦强调了基于亲代DNA变异的分离分析至关重要；二代测序提供的遗传结果必须谨慎解释，必要时应由生物信息学分析人员重新审查原始数据。对COL4A5基因已报道，且在多个人群数据库（包括dbSNP数据库、千人数据库和ESP6500基因组数据库）中频率极低的变异c.2858G>T（p.G953V）基于中国人重新评估致病性的研究显示^[16]，该变异不是导致X连锁Alport综合征致病性变异，在中国人中的频率可达0.0113。研究结果提示对已报道的致病性变异的解读必须结合患者的临床表现，且需注意人群数据库中某变异在不同种族中发生频率不同。可见研究性实验室对于精准诊断遗传性肾脏病必不可少。

综上所述，诊断性实验室在遗传性肾脏病分子诊断中的作用毋庸置疑，然而精准诊断此类疾病的基础是临床医生首先要识别出可能的此类疾病患者，然后依据患者表型选择恰当的遗传检测技术手段和合适的组织标本进行检测，获得遗传检测报告后应结合患者表型、可能的遗传模式以及共识指南等进行临床解读。此外，在研究性实验室中可有机地结合患者、应疾病需要设计实验方案、选择技术方法，对诊断性实验室无法解决的一些特殊问题进行求证、解决，从而为每一位患病个体及所在家庭的精准诊断、客观遗传咨询提供科学严谨的依据。