来源：凯莱英药闻
靶向蛋白降解 (Targeted proteindegradation，TPD) 技术利用细胞内天然存在的两大蛋白降解系统，即泛素化-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system, UPS）与溶酶体降解途径，实现对疾病相关蛋白的特异、高效降解，从而达到疾病治疗的效果。UPS是细胞内最重要的蛋白质降解途径，具有高度特异性和选择性，是细胞内环境稳定的关键调节因素，负责降解细胞80％的正常或异常的蛋白，并在细胞周期调控、信号转导、核酸密码翻译等多种生命过程中发挥重要作用，是目前细胞内参与TPD的主要途径。但是，依赖UPS降解蛋白时，需靶标蛋白具有胞质结构域，并要求降解剂具有细胞渗透性，因此将蛋白质降解的范围扩大到细胞外靶位有一定的限制。溶酶体降解技术作为一种非特异性蛋白质降解途径，能够参与表面膜蛋白和胞吞的胞外蛋白质、完整细胞器和蛋白多聚体的降解中，一定程度上补充了UPS的不足。
泛素化-蛋白酶体系统（UPS）与溶酶体降解途径区别
资料来源：凯莱英、生物经纬、赢迪资本
溶酶体降解途径主要基于内吞小泡和自噬两种途径：基于内吞小泡，建立了靶向嵌合体系统(Lysosometargetingchimaeras，LYTACs)；基于自噬，包括由伴侣蛋白介导的自噬 (Chaperone-mediatedautophagy，CMA)，自噬靶向嵌合体(Autophagy-TargetingChimera，AUTAC)，以及自噬连接化合物(Autophagosome-tetheringcompound，ATTEC)。
溶酶体降解途径的作用机制示意图
来源：文献[5]
它们（LYTAC、CMA、AUTAC、ATTEC等）与基于UPS的蛋白水解靶向嵌合分子（Proteinproteolysis targetingchimeras，PROTAC）技术区别如下：
资料来源：凯莱英、生物经纬、赢迪资本
1、LYTACs
Bertozzi等[1]基于内吞小泡的溶酶体途径，利用能够同时结合细胞表面溶酶体靶向受体(LTRs) 和跨膜蛋白胞外区段的抗体分子，建立了LYTACs。阳离子非依赖型甘露糖6-磷酸受体 (CI-M6PR) 是真核生物细胞内最为典型的LTR，它能将带有甘露糖6-磷酸(Mannose-6-phosphate，M6P) 残基的N-聚糖的蛋白质内源性转运至溶酶体并降解。当抗体或小分子与细胞膜外或细胞膜上的靶蛋白结合后，M6P基团会被CI-M6PR识别，CI-M6PR会将自身结合的蛋白转运至溶酶体进而完成蛋白的降解过程。
图片来源：文献[1]
在他们的研究中，将寡聚甘露糖-6-磷酸 (M6Pn) 共价交联在目标蛋白的特异性抗体上，识别目标蛋白后，交联的M6Pn会结合细胞表面的CI-M6PR，从而将多种胞膜蛋白如载脂蛋白E4(Apolipoprotein E4)、表皮生长因子受体 (EGFR)、程序性死亡蛋白配体-1 (PD-L1) 以及CD71运送至溶酶体进行降解。
2、CMA
CMA由伴侣蛋白如热激关联蛋白70(Hsc70) 等介导，伴侣蛋白与人体细胞中受损或有缺陷的蛋白质结合，并将其货物运送至细胞的溶酶体，然后溶酶体内的蛋白酶将货物蛋白消化并回收利用。为了成功地将其货物运入溶酶体，分子伴侣必须首先将物质“停靠”在称为LAMP2A的蛋白质受体上，溶酶体上的LAMP2A受体越多， CMA活性水平可能越高。CA通过增加LAMP2A受体的数量起作用。
图片来源：我爱生化公众号
Fan 等[2]将细胞穿膜肽（CPP）、CMA靶向基序（CTM）与蛋白结合域(PBD) 三种功能多肽融合，这种嵌合蛋白在原代神经元内能有效降解死亡相关蛋白激酶1 (DAPK1) 以及支架蛋白突触后致密区95 (PSD-95)。但CMA研究依赖于穿膜肽如TAT，因此，目前其治疗效果很大程度上受限于穿膜肽的递送效率。
3、AUTAC
Arimot等[3]根据自噬过程设计了AUTAC，主要包含两部分：降解标签鸟嘌呤类似物 (如S-鸟苷酸)和目标蛋白配体，鸟嘌呤类似物可以诱导目标蛋白的K63多聚泛素化标记，从而招募自噬体将其降解。该研究团队接下来设计了一系列靶向MetAP2、FKBP12、BET、TSPO等蛋白的AUTAC分子：这些分子的一端可以特异性识别靶蛋白，另一端为模拟S-guanylation修饰的基团，如下图所示：
图片来源：文献[3]
但是自噬过程步骤多且极其复杂，影响因素会非常多，因此稳定性较差。除此之外，S-鸟苷酸诱导的K63泛素化，AUTAC是否会出现脱靶效应以及在体内的效果如何等方面都还需深入研究。
4、ATTEC
鲁伯埙教授团队[4]基于自噬通路，采取招募胞浆微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associatedprotein light chain 3，LC3)的方式，建立了AUTAC。亨廷顿病 (Huntington’s disease，HTT dieases，HD) 是一种遗传性神经退行性疾病，目前已有研究表明突变的HTT蛋白 (mHTT) 是HD 的主要病因。该团队利用小分子微阵列的方法，筛选到能够同时结合mHTT和LC3，但不与野生型相互作用的ATTEC分子（如下图所示）。ATTEC在结合LC3后定位至自噬泡并将mHTT包入自噬体内，最终将其降解，而与此同时野生型并未受影响。
图片来源：文献[4]
基于溶酶体降解途径的CMA、LYTAC、ATTEC、AUTAC降解方法虽然在靶蛋白的降解上为我们提供了全新的思路，进一步扩展了TPD药物的靶点蛋白范围。但是，招募溶酶体途径的相关元件的具体机制仍未完全掌握，“劫持”细胞溶酶体降解途径是否会对机体造成影响尚不明确，因此，基于溶酶体途径的TPD药物还有很长的路要走，对工作机制的了解、结构的优化都将为其未来的发展铺平道路。
参考文献
[1] Banik SM, Pedram K, Wisnovsky S, etal.Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins.Nature, 2020, 584(7820):291-297.
[2] Fan XL, Jin WY, Lu J, et al. Rapid andreversible knockdown of endogenous proteins by peptidedirected lysosomaldegradation. Nat Neurosci, 2014,17(3): 471-480.
[3] Takahashi D, Moriyama J, Nakamura T, etal.AUTACs: cargo-specific degraders using selective autophagy. Mol Cell, 2019,76(5): 797-810.e10.
[4] Li ZY, Wang C, Wang ZY, et al.Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds.Nature, 2019, 575(7781): 203-209.
[5]Chen SP, Yang H, Jiang JL, et al. Researchprogress on targeted protein degradation technology and its applications indiseases therapy. Chin J Biotech, 2021, 37(12): 1-18.
